E

L’eau peptonée salée alcaline est un milieu d'enrichissement pour les Vibrio halophiles notamment pour la recherche de Vibrio parahaemolyticus dans les eaux conchylicoles et les coquillages marins vivants.

Il est recommandé par la norme AFNOR V 08-024, NF ISO 8914.

FORMULE (en g/l d’eau distillée)
-
Composition
- simple concentration
Peptone 20g
Sodium chlorure 30g
Eau 1000ml

-double concentration
Peptone 40g
Sodium chlorure 60g
Eau 1000ml

Dissoudre les composants dans l'eau en chauffant légèrement si nécessaire, jusqu'à complète dissolution.
Ajuster le pH de sorte qu'après stérilisation, il soit de 8,6 à 25°C.
Répartir le milieu par quantités de 10 ml dans les tubes de 180 mm x 18 mm ou en flacons de capacités appropriées

Stériliser à 121°C pendant 15 min.

UTILISATION

En ce qui concerne le milieu double concentration, ensemencer avec 10 ml de la solution mère ou 10 ml de la suspension mère.

Dans le cadre de la norme AFNOR ensemencer la prise d’essai (x g ou suspension mère) dans l’eau peptonée alcaline simple concentration et dans un autre milieu d’enrichissement (bouillon salé à la polymyxine). En général, introduire une prise d’essai de 25 g dans 225 ml de milieu.

Si une prise d’essai de 25 g n’est pas disponible, utiliser une plus faible quantité et ajouter la quantité adéquate de milieu d’enrichissement pour obtenir une dilution au dixième.

Incuber à 35 ou 37°C (selon accord) pendant 7 à 8 heures.

Si la dilution et l’incubation ne peuvent pas être réalisées le même jour, l ‘échantillon dilué doit être conservé jusqu’au lendemain entre 0°C et 5°C.

N.B. : pour les produits congelés, il est conseillé d’effectuer un second isolement après 18 heures d’incubation.




L’eau peptonée appelée aussi eau tryptonée est un milieu qui permet la croissance des germes ne présentant pas d’exigences particulières. Elle est surtout utilisée pour la recherche de la production d’indole à partir du tryptophane. Ceci nécessite l’utilisation d’une peptone riche en tryptophane mais exempte d’indole.

Ce milieu est préconisé dans le dénombrement d’Escherichia coli présumés par la technique du Nombre le Plus Probable, selon la norme AFNOR NF 08-020, ISO 7251. Il est utilisé notamment dans le cadre du test IMViC pour différencier les Entérobactéries.
En aérobiose, Escherichia coli dégrade le tryptophane en indole par l’intermédiaire d’une tryptophanase. L’indole produit est révélé par le réactif de Kovacs.
La capacité ou l’incapacité de former de l’indole à partir du tryptophane ou des composés analogues est un caractère taxonomique essentiel dans le cadre de l’identification des micro-organismes.

La peptone de caséine obtenue par dégradation trypsique (tryptone) contient un taux élevé en tryptophane.
Dans la norme ISO 6579 (V 08-013) relative aux directives générales concernant les méthodes de recherche des Salmonella le milieu préconisé pour la recherche de l’indole (appelé milieu tryptone-tryptophane) est supplémenté avec du tryptophane.

FORMULE (en g/l d’eau distillée)

Peptone exempte d’indole ou tryptone 10
Sodium chlorure 5


Répartir en tube à raison de 10 ml/ tube.
Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes.
Dans le cadre de la norme ISO 6579, ajouter 1 g de DL- Tryptophane.

UTILISATION ET LECTURE

1) Dénombrement Escherichia coli présumé (NF 08-020)
A partir des tubes contenant le milieu d’enrichissement sélectif (Bouillon à la tryptose et au lauryl sulfate) ayant donné un dégagement gazeux après incubation, ensemencer après un second passage sur un autre milieu d’enrichissement sélectif (Bouillon EC) et une nouvelle incubation, une série de tubes contenant de l’eau peptonée.

L’ensemencement s’effectue à l’öse dans le milieu préalablement chauffé à 45°C.

Incuber à 45°C pendant 24 à 48 heures et examiner cette série de tubes pour la production d’indole.

Ajouter 0,5 ml de réactif de Kovacs pour la recherche de l’indole, bien mélanger et examiner pendant 1 minute.
Pour chaque dilution, compter le nombre de tubes ayant une couleur rouge de la phase alcoolique indiquant la présence d’indole (tubes positifs)

Réactif de Kovacs

Diméthylamino-4 benzaldéhyde 5 g
Méthyl-2 butanol-1 ou pentanol-1 75 ml
Acide chlorhydrique 25 ml

Dissoudre le diméthylamino-4 benzaldéhyde dans l’alcool en chauffant doucement au moyen d’un bain d’eau réglable à environ 50°C à 55°C.
Refroidir et ajouter l’acide.
Mettre à l’abri de la lumière et conserver à 4°C.
Le réactif doit être de couleur jaune clair à brun clair.

2) Directives générales concernant les méthodes de recherche des Salmonella ( ISO 6579)
Ensemencer un tube de tryptone-tryptophane avec une colonie suspecte issue des milieux sélectifs préconisés par la norme et repiquée sur gélose nutritive.
Incuber à 35°C ou 37°C (selon accord) durant 24 h.
Après incubation, ajouter 1 ml de réactif de Kovacs.

3) Méthodes générales pour recherche de l’indole
Ensemencer un tube de milieu avec la bactérie à identifier.
Incuber à température adéquate pendant 24 h ou plus si nécessaire.
Ajouter 1 ml de Réactif de Kovacs ou, à défaut les autres réactifs suivants :

- AUTRES REACTIFS

Les formules suivantes correspondent aux quantités de réactif à ajouter à 10 ml de culture en eau peptonée :
• 1° formule :
Réactif d’Erlich : la formule et l’utilisation sont identiques à celles du réactif de Kovacs mais la solution d’aldéhyde s’effectue dans l’éthanol à 95° au lieu de l’alcool amylique.
• 2° formule :
1 ml d’alcool amylique plus 5 à 6 gouttes d’acide nitrique rendu nitreux par quelques cristaux de nitrite de sodium.
• 3° formule :
10 gouttes d’acide sulfurique plus 5 à 6 gouttes de nitrate de sodium à 0,1% (réaction indole-nitreuse de Salkowsky).

EXPRESSION DES RESULTATS

1) Dénombrement Escherichia coli présumé (NF 08-020)




Pour chaque échantillon examiné, retenir trois dilutions successives en choisissant la dilution la plus élevée révélant trois tubes positifs ainsi que les deux dilutions suivantes suivant immédiatement (c’est à dire celles dont les concentrations en échantillon sont égales au 1/10 et au 1/100 de celle précédemment choisie.

- S’il a été préparé un nombre insuffisant de dilutions , choisir à la place les trois dilutions les plus élevées de la série (c’est à dire celles ayant les plus faibles concentrations en échantillon).

- S’il n’existe pas de dilution présentant trois tubes positifs, choisir les trois dilutions les plus élevées de la série qui contiennent au moins une réponse positive.

Vérifier, selon le nombre d’échantillons examinés par lot, si les séquences de nombre de tubes positifs, correspondant aux dilutions sélectionnées sont acceptables du point de vue statistique.

Pour chaque séquence jugée acceptable , le coefficient NPP est obtenu au moyen du tableau ( Voir Annexe)

Le nombre d’Escherichia coli présumés par millilitre ou par gramme de produit est obtenu en multipliant le coefficient NPP par l’inverse du taux de dilution retenue la moins élevée (c’est à dire celle ayant la plus forte concentration en échantillon).
Dans le cas où la dilution retenue la moins élevée correspond aux tubes préparés à partir du milieu double concentration (ensemencement de 10 ml sur Bouillon à la tryptose et au lauryl sulfate DC), diviser préalablement le coefficient NPP par 10.

Exprimer le résultat par un chiffre compris entre 1,0 et 9,9 multiplié par 10x , x étant la puissance appropriée de 10.

Si le NPP est inférieur à 0,3 micro-organisme par millilitre ou par gramme de produit et si l’on a utilisé le mode opératoire approprié pour un faible nombre d’Escherichia coli présumés, exprimer le résultat de la façon suivante : « absence d’Escherichia coli, présumés dans 1 ml ou 1 g de produit ».

2) Directives générales concernant les méthodes de recherche des Salmonella ( ISO 6579) et méthode générale
- réaction positive : formation d’un anneau rouge,
- réaction négative : formation d’un anneau jaune-brun.




C’est un milieu de culture test utilisé avec différents composés réactionnels permettant des tests de fermentation pour l’identification biochimique des microorganismes.
Ce milieu est employé principalement pour l’étude de la fermentation des glucides par les micro-organismes.

La fermentation du composé réactionnel par la culture ensemencée se traduit par le virage du rouge de phénol au jaune. Pour tester des anaérobies, ajouter un peu d’agar pour stabiliser le milieu.

FORMULE (en g/l d’eau distillée)

Peptone de caséine 5.000
Peptone de viande 5.000
Sodium chlorure 5.000
Rouge de phénol 0.018


Si nécessaire, ajouter 0,5 à 1,0 g d’agar
Répartir à raison de 10 ml par tube muni d’une cloche de Durham.
Stériliser 15 mn à 121°C.

UTILISATION

Ajouter stérilement à chaque tube de milieu, au moment de l’emploi la solution stérile (par filtration) du glucide à étudier de façon à obtenir une concentration finale en glucide de 1%.
On peut avantageusement utiliser les composés réactionnels imprégnés sur disque de papier filtre stériles, les introduire dans les tubes après refroidissement à 60°C.

Ensemencer les tubes goutte à goutte avec les cultures pures des germes à identifier. Ensemencer un tube témoin ne contenant pas de composé réactionnel en tant que contrôle de croissance.

Incuber jusqu’à 14 jours à la température optimale (le plus souvent à 37°C)

LECTURE

Au cours de l’incubation, contrôler chaque jour en vue d’un virage du rouge de phénol ainsi que, le cas échéant, en vue d’un dégagement gazeux dans les cloches de Durham. En cas de dégradation éventuelle de l’indicateur coloré, celui ci peut être rajouté en solution à 5%, goutte à goutte, lors de la lecture.

Le rouge de phénol est jaune en milieu acide, rouge en milieu alcalin. Cet indicateur coloré traduira l’éventuelle acidification due à l’utilisation du sucre par un virage du rouge au jaune. La production de gaz sera visualisée au niveau de la cloche.





EDEL et KAMPELMACHER notèrent que les techniques de conservation alimentaire telles que l’augmentation de température, la dessication, la préservation chimique, les hautes pressions ou les modifications de pH offraient des conditions léthales aux Salmonelles. Un pré-enrichissement dans un milieu non sélectif permettaient la réparation des dommages cellulaires et facilitaient la récupération des Salmonelles.

L’eau peptonée tamponnée maintient le pH à un niveau tel que les bactéries sensibles à des pH bas ne sont pas inhibées. Ceci est particulièrement important chez les espèces issues de végétaux qui sont très sensibles à ces pH.

L’eau peptonée tamponnée est conforme aux normes AFNOR:

- V 08-010 (ISO 6887) relative aux règles générales pour la préparation des dilutions en vue de l’examen microbiologique,
- V 08-011 (ISO 4633) relative aux directives générales pour le dénombrement des microorganismes ; méthode par comptage des colonies obtenues à 30°C ;
- ISO 6579 (V 08-013) relative aux directives générales concernant les méthodes de recherche des Salmonella ;
- ISO 8523 (V 08-025) relative aux directives générales pour la recherche des Enterobacteriaceae après pré-enrichissement ;
- V 08-052, méthode de routine pour la recherche des Salmonella ;
- V 04-501, pour l’examen microbiologique des viandes et produits à base de viande,
- V 08-407 pour le dénombrement des spores thermorésistantes de Bacillus et de Clostridium thermophiles par la technique du nombre le plus probable
- V 59-104, relative à la recherche des Salmonella[/] dans la gélatine alimentaire.
- Norme FIL Internationale 93B :1995 pour la recherche des [i]Salmonella dans le lait et les produits laitiers.

Elle est utilisée comme diluant pour la préparations des dilutions et comme milieu de pré-enrichissement non sélectif lors de la recherche des Salmonella dans les produits alimentaires.
Elle permet notamment de revivifier les microorganismes ayant subi des traitements subléthaux.
Elle renferme un mélange de peptones permettant une croissance optimale des espèces recherchées en microbiologie alimentaire.
Le pH est maintenu à 7,0 par la présence d’un tampon phosphate


FORMULE (en g/l d’eau distillée)

Peptone pepsique de viande (1) 10
Sodium chlorure 5
Di-sodium hydrogénophosphate, 12 H2O 9
Potassium dihydrogénophosphate 1.5


Mettre en suspension et bien mélanger.
Chauffer doucement en agitant.
Porter à ébullition.
Répartir en flacons et autoclaver à 121°C pendant 20 minutes.
(1)ou tout autre peptone de qualité équivalente.

UTILISATION

L’eau peptonée tamponnée s’utilise soit pour préparer la solution mère (10% de prise d’essai dans 90% de diluant) soit pour effectuer les dilutions décimales qui en découlent. Dans tous les cas il convient de peser avec une incertitude de mesure de 5%, une masse mg ou un volume vml ( au minimum 10 g ou 10 ml, sauf spécification autre).
Ajouter une quantité d’eau peptonée tamponnée égale à 9 x mg ou 9 x vml. Cette quantité peut être mesurée de préférence en masse ou en volume avec dans les deux cas une incertitude de 5%.
Pour éviter le stress des microorganismes, il est conseillé d’utiliser l’eau peptonée tamponnée à température ambiante (sauf cas spécifiques). Si nécessaire, laisser déposer les grosses particules 15 minutes maximum ou utiliser des systèmes de filtration adéquats.
Préparer les dilutions décimales en transvasant 1 ml de la suspension mère dans un tube contenant 9 ml de diluant stérile (dilution 10-1). Pour une précision optimale ne pas introduire la pipette dans la suspension mère de plus de 1 cm.
Mélanger soigneusement de préférence avec un agitateur mécanique pendant 5 à 10 secondes et prélever, avec une nouvelle pipette stérile, 1 ml de la suspension 10-1 qui est placé dans 9 ml de d’eau peptonée tamponnée stérile (dilution 10-2). Continuer ainsi si nécessaire avec les dilutions suivantes, 10-3, 10-4….
Le temps qui s’écoule entre la fin de la préparation de la suspension mère et le moment ou l’inoculum rentre en contact avec le milieu de culture ne doit pas dépasser 45 minutes avec un maximum de 30 minutes séparant la préparation de la suspension mère au début de la préparation des dilutions décimales.

- Pour les Salmonella, en général pour préparer la suspension mère ajouter une prise d’essai de 25 g dans 225 ml d’eau peptonée tamponnée, ce qui correspond au rapport prise d’essai/milieu de pré enrichissement spécifié dans les directives générales concernant les méthodes de recherche des Salmonella .

Si la prise d’essai prescrit n’est pas de 25 g, utiliser la quantité nécessaire de milieu de pré-enrichissement pour obtenir approximativement une dilution au 1/10 (masse à volume). Pour les laits fermentés, yaourts, crèmes, desserts, il est préconisé l’emploi de billes de verre pour mieux disperser l’échantillon.

- Dans le cas de cacao ou de produits contenant du cacao il est préférable d’ajouter 50 g/l de caséine (éviter l’emploi de caséine acide), ou bien 100 g de lait écrémé en poudre, et ajouter après deux heures d’incubation, 0.018 g/l de vert brillant, si le produit contient beaucoup de flore secondaire Gram positif.

- Dans le cas d’aliments acides et acidifiants, s’assurer que la valeur de pH ne descend pas en dessous de 4,5 pendant le pré-enrichissement.

Incuber cette suspension mère qui constitue le pré-enrichissement à 37°C+/- 1°C pendant 18 h +/- 2 h.
Cette solution sert ensuite à l’enrichissement sélectif sur Rappaport-Vassiliadis (RVS) et sur Muller-Kaufman au tétrathionate-novobiocine (bouillon MKTTn)







La gélose à l’eau de mer sert au dénombrement des germes aérobies dans les poissons d’eau de mer.

FORMULE

Extrait de viande 10g
Peptone 10g
Eau de mer (âgée et filtrée) 750 ml
Eau du robinet 250 ml
Agar 15 g

Mélanger sans la gélose, et faire bouillir.
Ajuster le pH à 7,8.
Filtrer.
Ajuster à nouveau le pH à 7,3.
Ajouter à la gélose et chauffer jusqu’à dissolution.
Filtrer.
Répartir en flacons ou en tubes et stériliser 15 minutes à 120°C.




L’eau physiologique peut être utilisée pour la préparation de suspensions-dilutions.


FORMULE (en g/l d’eau distillée)

Sodium chlorure 9

Répartir en flacons ou en tubes.
Stérilisation : 20 min à 121°C.




Le milieu E.C. est employé pour les méthodes standard de différenciation et de numération des coliformes.

C’est un milieu développé par HAJNA et PERRY dans un effort d’améliorer la capacité de détection dus coliformes et d’Escherichia coli. Ce milieu consiste en un bouillon lactosé tamponné associé à 0,15% de sels biliaires n°3.
Ces sels biliaires contenus dans le milieu ont la propriété d’inhiber les bactéries sporulées et les streptocoques fécaux en favorisant la croissance d’Escherichia coli. Pour la mise en évidence d’E. coli, il est préconisé une incubation à 45°C. A 37°C, les coliformes sont mis en évidence. Les germes lactose-positifs se traduisent par la fermentation du lactose avec formation de gaz.

FISHBEIN et SURKIEWICZ utilisèrent le milieu EC pour la confirmation de la présence d’Escherichia coli à partir d’aliments surgelés. Cette étude montra que le test était optimal lorsqu’il était conduit à 45,5°C avec une incubation limitée à 24 heures.

Ce milieu est utilisé dans la norme française pour le dénombrement d’Escherichia coli présumés dans les produits alimentaires par la technique du nombre le plus probable. Dans ce cadre, il est associé à de l’eau peptonée pour la recherche de l’indole à 45°C (AFNOR V 08-020 ; ISO 7251) .

FORMULE (en g/l d’eau distillée)

Tryptose ou trypticase 20.0
Lactose 5.0
Sels biliaires n°3 1.5
Di-potassium hydrogénophosphate 4.0
Potassium dihydrogénophosphate 1.5
Sodium chlorure 5.0


Mettre en suspension et bien mélanger.
Chauffer doucement en agitant.
Répartir le milieu, par quantités de 10 ml dans des tubes contenant des cloches de Durham.
Stériliser à l’autoclave réglé à 121°C pendant 15 minutes.
Les cloches de Durham ne doivent pas contenir d’air après stérilisation.

UTILISATION ET LECTURE

A partir de chaque tube de milieu d’enrichissement sélectif (bouillon à la tryptose et au lauryl sulfate) incubé et présentant un dégagement gazeux, ensemencer à l’aide de l’anse bouclée le bouillon EC préalablement chauffé à 45°C.

Incuber les tubes ensemencés au bain marie à 45°C durant 24 +/- 2 h. Si à ce stade, il n’y a pas de dégagement gazeux, incuber durant 48 heures.

A partir de chaque cube incubé précédemment et présentant un dégagement gazeux, ensemencer à l’aide d’une anse bouclée, un tube d’eau peptonée préalablement chauffé à 45°C.




Le milieu EE est un milieu favorisant la croissance des Entérobactéries.
Il est préconisé pour le dénombrement sans revivification des Enterobacteriaceae par la technique NPP selon la norme AFNOR ISO 7402 (V08-021) et dans les directives générales pour la recherche des Enterobacteriaceae avec pré-enrichissement –Norme AFNOR ISO 8523 (V08-025).

FORMULE (en g/l d’eau distillée)

- simple concentration
Peptone 10.000
Glucose 5.000
Di-sodium hydrogénophosphate 6.450
Potassium dihydrogénophosphate 2.000
Bile de bœuf déshydratée 20.000
Vert brillant 0.015


Les ingrédients sont doublés pour la double concentration
Dissoudre les composants en portant le tout à ébullition. Ne pas chauffer le milieu plus de 30 minutes. Refroidir le milieu rapidement.
Répartir par quantités de 10 ml dans des tubes stériles.
Ne pas stériliser à l’autoclave.
Le milieu peut être conservé 1 semaine au maximum entre 0°C et 5°C.

UTILISATION ET LECTURE

1) Dénombrement des Enterobacteriaceae (ISO 7402)
Préparer une seule série de dilutions décimales à partir de l’échantillon pour essai si le produit est liquide, ou de suspension mère dans le cas d’autres produits.

Prendre trois tubes de milieu double concentration. Transférer, dans chacun de ces tubes, à l’aide d’une pipette stérile, 10 ml de l’échantillon pour essai ou 10 ml de la suspension mère.
Prendre trois tubes de milieu simple concentration. Transférer dans chacun de ces tubes, à l’aide d’une nouvelle pipette stérile 1 ml de l’échantillon pour essai ou 1 ml de la suspension mère.

Prendre trois autres tubes de milieu simple concentration. Transférer, dans chacun de ces tubes, à l’aide d’une nouvelle pipette stérile, 1 ml de la première dilution décimale (10-1) de l’échantillon pour essai ou 1 ml de la première dilution décimale de la suspension mère (10-2).

Faire incuber ces neuf tubes durant 24 heures à 35°C ou 37°C.

Ensemencer en strie une anse de chacune des neuf cultures incubées sur des boîtes de gélose VRBG (gélose à la bile, au cristal violet et au glucose) et faire incuber les boîtes à 35°C ou 37°C durant 24 heures.

2) Recherche des Enterobacteriaceae après enrichissement (ISO 8523)
La suspension mère ou la prise d’essai est ensemencée dans de l’eau peptonée tamponnée et incubée à 35 ou à 37°c (selon accord) pendant au moins 16 heures et au plus 20 heures.

Transférer 1 ml de la culture obtenue dans un tube contenant 10 ml du milieu EE simple concentration.

Incuber le milieu ensemencé à 35 ou 37°c (selon accord) pendant 18 h à 24 h.

Procéder ensuite à l’isolement en ensemençant en stries une anse de milieu d’enrichissement incubé sur le milieu sélectif ( gélose à la bile, au cristal violet et au glucose ).




La gélose lactosée à l’éosine et au bleu de méthylène (E.M.B. : milieu de Teague-Levine) est un milieu utilisé pour l’isolement et la différenciation des entérobactéries capables de fermenter rapidement le lactose de celles qui ne le fermentent pas.

Elle peut également servir à l’identification des Candida albicans. La teneur en colorant inhibe toute la flore secondaire par adjonction de chlorhydrate de chlorotétracycline.
Elle est préparée selon les recommandations de “l’American Public Health Association”.
C’est un milieu conforme aux exigences de l’USP XXIII (1995).

En 1916, HOLT-HARRIS et TEAGUE employèrent une association d’éosine et de bleu de méthylène pour différencier les microorganismes suivant leur aptitude à fermenter ou non le lactose. Le saccharose compris dans le milieu permettait de détecter les coliformes qui fermentaient celui-ci plus rapidement que le lactose. Par la suite, Levine modifia la formule en supprimant le saccharose et en augmentant le concentration en lactose ; ce qui permit de différencier aisément Escherichia coli et Enterobacter aerogenes.

L’éosine Y et le bleu de méthylène sont des agents faiblement sélectifs. Ils n’inhibent que partiellement le développement des Gram-positifs tels que les Entérocoques.
Ces colorants assurent la différenciation entre les germes lactose-positifs et les germes lactose-négatifs.

Dans le cadre normatif français, (normes NF 08-016 (ISO 4831) en remplaçant le terme coliforme par coliformes fécaux et NF 08-017), ce milieu s’inscrit dans le dénombrement des coliformes fécaux et d’Escherichia coli, pour l’isolement des repiquages effectués à partir de milieux liquides (B.L.B.V.B.) ou solides (V.R.B.L.) incubés à 44°5C.




FORMULE (en g/l d’eau distillée)

Peptone 10.000
Lactose 10.000
Bi-potassium hydrogénate 2.000
Eosine Y 0.400
Bleu de méthylène 0.065
Agar 15.000


Dissoudre les ingrédients dans l’eau et porter à ébullition.
Répartir le milieu dans des flacons de capacité appropriée.
Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes.
Refroidir à 60°C et agiter le milieu de façon à oxyder le bleu de méthylène (le milieu devient bleu), et à dissoudre le précipité qui est un constituant important du milieu.

UTILISATION

1) CAS DU DENOMBREMENT DES COLIFORMES FECAUX AVEC COMPTAGE DES COLONIES
Sur chaque boîte de VRBL retenue pour le dénombrement des coliformes fécaux, prélever avec un fil d’ensemencement droit un nombre de colonies caractéristiques, en général égal au nombre entier le plus proche de la racine carrée du nombre de colonies caractéristiques

Nombre de colonies caractéristiques à prélever pour le nombre de colonies caractéristiques dénombrées
</=5 Prélever toutes les colonies caractéristiques
6 à 30 : 5
31 à 40 : 6
41 à 55 : 7
56 à 70 : 8
71 à 90 : 9
91 à 110 : 10
111 à 135 : 11
136 à 150 : 12

A partir de chaque colonie prélevée, effectuer un isolement sur boîte de milieu gélosé EMB.

2) CAS DU DENOMBREMENT DES COLIFORMES FECAUX AVEC CALCUL DU NPP

A partir de chaque tube positif obtenu au cours du dénombrement des coliformes fécaux, prélever une anse de culture et effectuer un isolement sur gélose EMB.

Dans l’un ou l’autre cas, incuber 24 heures à 37°C.

LECTURE

A) D’une manière générale :
- Colonies de 2 à 3 mm de diamètre, plates, violet très foncé avec souvent un reflet métallique ayant tendance à confluer. Par transparence, elles présentent un centre opaque occupant les 3/4 de leur surface : Escherichia coli..
- Grosses colonies de 4 à 6 mm, convexes ayant tendance à confluer. La zone centrale, moins opaque et plus petite proportionnellement que celle des colonies de E. coli, est souvent déprimée et peut présenter, en lumière réfléchie, un reflet métallique. Le reste de la colonie ne présente pas, contrairement à celle des E. coli, ce reflet métallique : Klebsiella et Enterobacter.
- Petites colonies grises de 1 à 2 mm de diamètre : Salmonella, Shigella.

- Colonies violet pâle, avec un centre et un reflet métallique très peu marqués : Citrobacter[/].
- Petites colonies grises de 2 mm : [i]Proteus (les Proteus mirabilis et vulgaris peuvent former une pellicule autour des colonies).
- Colonies légèrement bleutées, plates, à surface irrégulière de 2 à 4 mm de diamètre : Pseudomonas aeruginosa.
- Colonies grises, opaques, très petites (0,5 mm) : Enterococcus faecalis.
- Colonies ayant un aspect mycélien et se développant après 24 ou 48 heures en atmosphère en CO2 : Candida albicans.

2) Dans le cadre normatif repérer les colonies caractéristiques (lactose positif) c’est à dire les colonies à centre opaque et à reflet métallique.

Repiquer deux colonies caractéristiques sur boîte de gélose nutritive afin de procéder ultérieurement au test IMViC.

La gélose d’Endo est utilisée pour effectuer des tests confirmatifs de recherche et de dénombrement des coliformes à la suite de tests présomptifs pour les eaux d’alimentation ainsi que pour la recherche et l’isolement des coliformes et coliformes thermotolérants dans le lait, les produits laitiers et les autres produits alimentaires. C’est un milieu recommandé par l’American Public Health Association pour les méthodes standards d’analyse des eaux et des produits laitiers.

En 1904, ENDO a étudié et mis au point un milieu dépourvu de sels biliaires qui puisse convenir à la différenciation des entérobactéries suivant leur aptitude à fermenter le lactose. L’inhibition des germes Gram-positifs était réalisée en présence de sulfite de sodium et de fuschine basique. La gélose d’Endo a principalement été développée, à l’origine, pour faciliter l’isolement et l’identification de bacilles typhiques.

Par suite de la teneur en sulfite de sodium et en fuchsine, la culture des bactéries Gram-positives est nettement freinée. Les coliformes dégradant le lactose donnent un aldéhyde et de l’acide. L’aldéhyde libère la fuchsine de la fuchsine sulfitée et cette dernière va colorer les colonies en rouge. Cette réaction est si intense avec Escherichia coli que la fuchsine cristallise et communique aux colonies un reflet métallique constant vert chatoyant (reflet de la fuchsine).

Le gélose Endo est utilisée en boîte de Petri pour mettre en évidence les coliformes dans le lait, l’eau ou d’autres produits de ce type

FORMULE (en g/l d’eau distillée)

Peptone bactériologique 10.0
Di-potassium hydrogénophosphate 3.5
Sodium sulfite 2.5
Lactose 10.0
Fuchsine basique 0.5
Agar 15.0


Il est recommandé de solubiliser dans un premier temps la fuchsine en la mouillant avec 40 ml d’éthanol. Chauffer ensuite jusqu’à complète dissolution.
Stériliser à l’autoclave pendant 15 minutes à 120°C.
Si le milieu présente, après refroidissement, une coloration rouge persistante gênant la lecture, on peut s’en débarrasser en ajoutant quelques gouttes d’une solution fraîchement préparée de sulfite de sodium et en faisant bouillir.
Les milieux prêts pour l’utilisation doivent être rose pâle et non rouges ; plusieurs précautions doivent être respectées :
- ne pas couler le milieu trop chaud,
- éviter un séchage trop poussé
- ne conserver que 2 à 3 jours et impérativement au froid et à l’obscurité.

UTILISATION ET LECTURE

Ensemencer par étalement en surface ou en posant une membrane ayant servi à la filtration.

- Bactéries lactose-positives (coliformes) : colonies rouges présentant souvent un éclat métallique.

- Bactéries lactose-négatives : colonies incolores



Ce milieu est particulièrement utile pour différencier Listeria monocytogenes de Erysipelothrix rhusiopathiae. On peut également l’employer pour faciliter le diagnostic des Yersinia, des Bacillus à Gram négatif aérobies stricts, des Streptococcus et des Bacillus.

Certaines bactéries hydrolysent l’esculine en rompant la liaison glucosidique libérant du glucose et de l’esculétine. Par sa fonction phénol, l’esculétine donne avec des sels de fer une réaction colorée noire.

FORMULE (en g/l d’eau distillée)

Bio-trypcase 17.0
Bio-thione 3.0
Esculine 1.0
Fer citrate ammoniacal 0.5
Agar 15,0


Répartir en tubes étroits (180 x 90) à raison de 4 ml / tube.
Stériliser à l’autoclave à 110°C pendant 30 minutes.

UTILISATION ET LECTURE

Ensemencer le milieu par piqûre centrale à l’aide d’un fil de platine chargé de la culture bactérienne (il est nécessaire ensuite de revisser à fond le bouchon).

Incuber à la température adéquate : 37°, 30° ou 22°C.
Observer pendant 5 jours :

- Noircissement : réaction positive.
- Absence de noircissement : réaction négative
-
(Au besoin comparer avec un tube de milieu non ensemencé).