c

La gélose caséine soja appelée aussi CASO agar est un milieu nutritif universel exempt d’inhibiteurs et d’indicateurs, prévu pour un large éventail d’application.
Il correspond aux exigences de l’USP XXI (1985), de l’European Pharmacopoeia (1980) et du Deutsches Arzneibuch.

Par adjonction de 5 g/l de Tween 80 et 0.7 g/l de lécithine, elle est utilisée pour la numération des germes en cosmétologie.
Coulée en boîtes quadrillées ou sur languettes, elle convient dans les tests rapides pour l’examen des surfaces.

La base nutritive riche de ce milieu convient même à la culture de microorganismes exigeants. L’association entre la tryptone et la peptone papaïnique de soja réalise une synergie entre l’apport protidique de la caséine et l’apport glucidique du soja, permettant ainsi d’obtenir une croissance optimale pour un nombre élevé de germes exigeants et non exigeants. Il peut être utilisé tel quel, même sous forme de bouillon (sans agar) ou comme base pour la préparation de milieux spéciaux (agar au sang par exemple).

Il est préconisé par la norme AFNOR V 08-027 (NF ISO 10273) concernant les directives générales pour la recherche des Yersinia enterolitica présumées pathogènes. Il sert dans ce cas à la recherche de l’exigence en calcium à 25°C et de la recherche de la pyrazinamidase.


FORMULE

.1) Milieu de base

Tryptone 15g
Peptone papaïnique de soja 5g
Sodium chlorure 5g
Agar 15g
Eau distillée 15 g



Dissoudre les composants en chauffant si nécessaire.
Répartir le milieu dans des flacons de capacité appropriée.
Stériliser à l’autoclave réglé à 121°C pendant 15 minutes.

2) Recherche de la pyrazinamidase

Tryptone 15g
Peptone de soja 5g
Sodium chlorure 5g
Pyrazine carboxamide 1g
Agar 15g
Tampon tris-maléate (0,2 mol/l, pH=6) 1000ml



Dissoudre les composants en chauffant si nécessaire.
Répartir le milieu par quantité de 10 ml dans des tubes de capacité appropriée.
Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes.
Après stérilisation, laisser refroidir en position inclinée de façon à obtenir une pente longue.

3) Gélose caséine soja au magnésium et à l’oxalate
a) Milieu de base

b) Solution de chlorure de magnésium
Magnésium chlorure hexahydraté (0,25 mol/l) 5,09 g
Eau 100 ml

Dissoudre le chlorure de magnésium dans l’eau.
Stériliser par filtration.

c) Solution d’oxalate de sodium
Oxalate de sodium 3,35 g
Eau 100 ml

Dissoudre l’oxalate de sodium dans l’eau.
Stériliser par filtration.

d) Solution de glucose
Glucose 18 g
Eau 100 ml

Dissoudre le glucose dans l’eau.
Stériliser par filtration.

e) Milieu complet

Milieu de base 830ml
Solution de chlorure de magnésium 80ml
Solution d’oxalate de sodium 80ml
Solution de glucose 10ml


Ajouter stérilement les solutions de chlorure de magnésium, d’oxalate de sodium et de glucose au milieu de base refroidi à environ 45°C et mélanger.

Couler environ 15 ml du milieu complet refroidi à environ 45°C dans des boîtes de Petri. Laisser se solidifier.


UTILISATION ET LECTURE

Elles peuvent être différentes selon le but recherché.

Dans le cadre de la norme sur Yersinia enterolitica, mettre en suspension dans une solution saline une fraction de chacune des colonies isolées sur gélose nutritive de façon à obtenir une suspension d’environ 103 bactéries par millilitre.

a) Recherche de la pyrazinamidase
Ensemencer une grande superficie de la pente de la gélose.
Incuber à 30°C pendant 48 heures.
Ajouter 1 ml d’une solution de sulfate de fer ammoniacal à 1% dans l’eau.

L’apparition d’une couleur rose-marron indique une réaction positive.

b) Recherche de l’exigence en calcium à 25°C
Juste avant l’emploi, sécher soigneusement les boîtes de gélose, de préférence après avoir retiré le couvercle et retourné les boîtes, dans une étuve réglée entre 37°C et 55°C jusqu’à séchage de la surface de la gélose.

Ensemencer par étalement 0,1 ml de chaque suspension sur :
- deux boîtes de gélose caséine soja (boîtes témoins) et
- deux boîtes de gélose caséine soja au magnésium et à l’oxalate.

Incuber respectivement une boîte de chaque milieu pendant 48 h, à 25°C et à 37°C.

La réaction est considérée positive si, à 25°C, les colonies ont une taille homogène et si à 37°C, et en présence de magnésium et d’oxalate, on observe une inhibition de la culture, c’est à dire une culture dissociée en petites colonies d’environ 0,1 mm de diamètre (avec une proportion de petites colonies supérieures à 20%).

Les colonies inhibées sont calcium dépendantes et présumées pathogènes.







Campylobacter fetus est connu comme l’agent pathogène des avortements enzootiques et des entérites chez les animaux domestiques. Chez l’homme, les entérites sont surtout dues aux Campylobacter jejuni et Campylobacter coli. Les voies de transmission les plus fréquentes vers l’homme sont les aliments provenant d’animaux atteints, l’eau ainsi que le contact direct avec ces animaux

Un milieu de culture riche en substances nutritives et incubé en atmosphère gazeuse réduite en oxygène (5 à 10%) et enrichie en dioxyde de carbone permet une bonne croissance des Campylobacter. La céfopérazone ajoutée sous forme de supplément sélectif des Campylobacter inhibe une grande partie de la flore secondaire.

Il est recommandé comme milieu sélectif dans la norme AFNOR V 08-026 (ISO 10272) concernant la méthode horizontale pour la recherche de Campylobacter thermotolérants.


FORMULE (en g/l d’eau distillée)
.
Extrait de viande 10.00
Peptone 10.00
Sodium chlorure 5.00
Charbon 4.00
Hydrolysat de caséine 3.00
Sodium désoxycholate 1.00
Fer sulfate (III) 0.25
Sodium pyruvate 0.25
Agar 8 à 18



Dissoudre les composants de base en portant à ébullition
Répartir le milieu dans des flacons appropriés.
Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes.

1) Solution de céfopérazone
Céfopérazone 0,064 g
Eau distillée 20 ml

Dissoudre la céfopérazone dans l’eau.
Stériliser par filtration.

2) Milieu complet
Milieu de base 990 ml
Solution de céfopérazone 10 ml

Ajouter stérilement au milieu de base préalablement fondu puis refroidi à environ 45°C, la solution de céfopérazone , et mélanger.
Verser environ 15 ml du milieu complet dans des boîtes de Petri stériles. Laisser se solidifier.

Juste avant emploi, sécher soigneusement les boîtes de milieu gélosé, de préférence après avoir retiré les couvercles et retourné les boîtes dans une enceinte de séchage pendant 30 minutes ou jusqu’à ce que la surface de la gélose soit exempte d’humidité visible.

Si elles ont été préparées à l’avance, les boîtes de milieu gélosé non séchées ne doivent pas être conservées plus de 4 heures à la température ambiante ou plus de 3 jours à +4°C.


UTILISATION ET LECTURE

a) Isolement direct
Pour les produits suspectés contenir une quantité importante de Campylobacter thermotolérants, procéder à un isolement en ensemençant à l’aide d’une anse bouclée, la suspension mère non incubée sur la surface de la gélose KARMALI (milieu sélectif obligatoire préconisé par la norme) et éventuellement sur un autre milieu sélectif pouvant être la gélose CCDA.

Incuber à 42°C en atmosphère microaérophile (oxygène 5%, dioxyde de carbone 10%, azote 85%).
Examiner après 48 h, 72 h et, éventuellement 5 jours, pour contrôler s’il y a présence de colonies présumées être des Campylobacter thermotolérants.
Procéder alors à la confirmation.

b) Isolement après enrichissement
Ensemencer, à l’aide d’une anse bouclée, la surface d’une gélose KARMALI ainsi que la surface d’une gélose CCDA avec la culture obtenue dans le milieu d’enrichissement (Bouillon de PRESTON ou bouillon de PARK et SANDERS).

Incuber les boîtes à 42°C en atmosphère microaérophile.
Après 24 h, ou plus généralement, 48 h et même 3 jours à 5 jours d’incubation, examiner les boîtes afin de rechercher la présence de colonies caractéristiques de Campylobacter thermotolérants.

Procéder ensuite à la confirmation en sélectionnant cinq colonies typiques et /ou suspectes sur l’ensemble des boîtes ensemencées ; s’il y en a moins de cinq, retenir toutes les colonies.

Comme les germes ne survivent qu’en atmosphère micro-aérophile, appliquer les tests ultérieurs sans délai.

A partir des colonies isolées, réaliser une coloration de Gram et mettre en œuvre les études morphologiques (mobilité), physiologiques (croissance à 25°C) et biochimiques (fermentation du glucose, utilisation du lactose et/ou du saccharose , production d’hydrogène sulfuré, recherche de la catalase, de la sensibilité à l’acide nalidixique et à la céphalotine, de l’hydrolyse de l’hippurate)

Les Campylobacter thermotolérants sont de petits bacilles incurvés, à mobilité avec des déplacements en vrille caractéristiques, Gram -, oxydase +, glucose, lactose et saccharose négatifs.

Parmi les Campylobacter spp présentant une croissance à 42°C, certaines espèces constituent le groupe des thermotolérants dont les plus fréquemment rencontrés sont les Campylobacter jejuni et les Campylobacter coli.

Selon l’interprétation des résultats, indiquer la présence ou l’absence de Campylobacter thermotolérants dans une prise d’essai de x g ou x ml de produit.






Le milieu CFC est un milieu de base utilisé pour l’isolement sélectif des Pseudomonas associés à la contamination des viandes de volaille.

La formulation du milieu de base constitue une modification du milieu de King A dans lequel le chlorure de magnésium et le sulfate de potassium favorisent la production de pyocyanine.

Le supplément C.F.C. a été mis au point par MEAD et ADAMS en 1976 afin de permettre le développement sélectif de la majorité des Pseudomonas psychrophiles qui contaminent les produits d’origine aviaire.

La peptone pancréatique de gélatine et la tryptone constituent les substrats nutritifs nécessaires à la multiplication rapide des Pseudomonas.
La production de pyocyanine (pigment bleu, non fluorescent, soluble dans l’eau et le chloroforme) est stimulée par la présence de chlorure de magnésium et de sulfate de potassium.
La concentration en céphalosporine permet d’inhiber la majeure partie des germes contaminants et plus particulièrement les Entérobactéries, les Staphylocoques et les Streptocoques.
La fucidine inhibe le développement des Acinetobacter/Moraxella sans intervenir sur la croissance des Pseudomonas.
Les levures contaminantes sont inhibées par le cétrimide.
La céphalosporine, la fucidine et le cétrimide sont apportés extemporanément dans le milieu.

Ce milieu est recommandé par la norme AFNOR NF V 04-504 pour le dénombrement des Pseudomonas dans les viandes et produits à base de viande.


FORMULE (en g/l d’eau distillée)

Peptone pancréatique de gélatine 16.0
Hydrolysat de caséine (tryptone) 10.0
Potassium sulfate 10.0
Magnésium chlorure 1.4
Agar 12 à 18



Dissoudre les composants en portant à ébullition.
Répartir le milieu par quantités de 100 ml dans des flacons de 300 ml de capacité maximale.
Stériliser à 121°C pendant 15 minutes.

1) solution d’inhibiteurs
- solution de cétrimide : solution A
Cétrimide 0,1 g
Eau 100 ml

- solution de fucidine : solution B
Fucidine 0,1 g
Eau 100 ml

- solution de céphalosporine : solution C
Céphalosporine 0,1 g
Eau 100 ml

Dissoudre la cétrimide, la fucidine et la céphalosporine dans l’eau.
Filtrer séparément sur membrane filtrante.

2) Milieu complet
Milieu de base 100 ml
Solution A 1 ml
Solution B 1 ml
Solution C 5 ml

Ajouter stérilement les solutions au milieu de base fondu et maintenu à 45°C puis mélanger.


UTILISATION

Déposer 1 ml de la suspension mère dans chacune de deux boîtes de Petri stériles. Opérer de même avec les dilutions successives suivantes, à l’aide d’une nouvelle pipette stérile à chaque dilution décimale.

Couler dans chaque boîte de Petri environ 15 ml du milieu F.C.F. maintenu en surfusion à 45°C. Le temps qui s’écoule entre la préparation de la suspension mère et le moment où les dilutions sont en contact avec le milieu ne doit pas dépasser 15 minutes.

Mélanger soigneusement l’inoculum au milieu de culture et laisser se solidifier en posant les boîtes de Petri sur une surface fraîche et horizontale.

Faire incuber les boîtes ainsi préparées et retournées à 22°C, pendant 48 heures. Si les colonies ne sont pas bien développées après ce temps d’incubation, prolonger de 24 heures.

LECTURE

Après la période d’incubation, procéder au comptage des colonies pour chaque boîte ne contenant pas plus de 300 colonies. Prélever, au hasard, 5 colonies sur chacune des boîtes contenant entre 15 et 300 colonies

Procéder alors à la confirmation après repiquage sur gélose nutritive. La confirmation nécessite la recherche de l’oxydase et l’utilisation des sucres sur milieu de Kligler.

Le milieu de Chapman mannité est un milieu sélectif pour l’isolement des Staphylocoques sur la base d’une tolérance à une forte teneur en NaCl. KOCH a montré que les Staphylocoques ne sont pas inhibés par des concentrations en NaCl de 7,5%. CHAPMAN a confirmé ces premiers résultats en observant que les Staphylocoques coagulant le plasma de lapin présentaient des colonies jaunes sur le milieu auquel il a donné son nom, alors que la plupart des autres bactéries étaient inhibées.
Ce milieu peut servir également à la présomption de la présence de Staphylococcus aureus par la dégradation du mannitol et la production fréquente de pigments.

Ce milieu est conforme aux exigences de l’USP XXIII (1995).

Cependant, certains autres micro-organismes peuvent s’y développer (Bacillus, Streptococcus D, Corynebacterium) mais les délais de croissance et l’aspect des colonies permettent de les différencier facilement.

Pour une meilleure inhibition de l’espèce Bacillus, il est recommandé d’ajouter de l’azide de sodium (65mg/litre).


FORMULE (en g/l d’eau distillée)


Peptone bactériologique 10.000
Extrait de viande de bœuf 1.000
Sodium chlorure 75.000
Mannitol 10.000
Rouge de phénol 0.025
Agar 15,000



Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes.
Après que le milieu soit coulé en boîtes de Pétri, ne pas faire sécher les boîtes sous peine d’augmenter la concentration en NaCl par dessication. La teneur de ce dernier deviendrait alors inhibitrice, même pour les Staphylocoques.

UTILISATION

Ensemencer abondamment les boîtes de Petri pour l’isolement. Une numération peut être effectuée en étalant 0,1 ml d’une suspension-dilution bactérienne.
La lecture des résultats est effectuée après 36 heures d’incubation à 37°C.

LECTURE

Les souches de Staphylococcus aureus forment des colonies luxuriantes et élaborent leur propre pigment. Les colonies s’entourent en 24 à 48 heures d’une auréole jaune due à la fermentation du mannitol.

Les souches de Staphylococcus eperdimidis, comme d’autres Staphylocoques, donnent des colonies rosées qui, dans la majorité des cas, se développent sans modifier la teinte du milieu. Cependant, il faut noter qu'une minorité non négligeable de souches de Staphylococcus autres que Staphylococcus aureus est capable de fermenter le mannitol.

Cette épreuve, qui permet seulement d’orienter le diagnostic (présomption) devra toujours être complétée par la recherche de la coagulase, et éventuellement, de la désoxyribonucléase et de la phosphatase.






La gélose au Chloramphénicol est le milieu recommandé pour le dénombrement des levures et des moisissures dans les produits alimentaires.

Cette gélose est conforme aux normes : AFNOR NF V08 022 (ISO 7954) relative aux directives générales pour le dénombrement des levures et des moisissures par la technique de comptage des colonies à 25°C, XP V08-059 relative à la méthode de routine pour le dénombrement des levures et moisissures par comptage des colonies à 25°C, NF V 04-015 concernant le dénombrement des levures et des moisissures dans les laits de conserve et ISO 7698 concernant le dénombrement des bactéries, levures et moisissures dans les céréales, légumineuses et produits dérivés.

Elle est également recommandée pour le dénombrement en gélose de levures probiotiques en alimentation animale (méthode utilisée par les services de la répression des fraudes).

Les éléments nutritifs nécessaires au développement des colonies de levures et de moisissures sont apportés par l’extrait de levure et de glucose.

L’utilisation du chloramphénicol, antibiotique thermostable, entraîne l’inhibition de la quasi-totalité des espèces bactériennes (Gram + et Gram -) initialement présentes dans l’échantillon.
Le pH acide (6,6) est également un facteur de sélectivité.


FORMULE (en g/l d’eau distillée)


Extrait de levure 5,0
Glucose 20.0
Chloramphénicol 0.1
Agar 12.0



Dissoudre les composants en portant à ébullition.
Répartir le milieu dans des récipients appropriés
Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes.

Le chloramphénicol peut être remplacé par de l’oxytétracycline. L’oxytétracycline s’ajoute après autoclavage du milieu. Celui-ci, refroidi à 45°C au bain-marie, est supplémenté avec une solution à 0,1% de chlorhydrate d’oxytétracycline dans de l’eau, stérilisée par filtration, et à raison de 10 ml pour 100 ml de milieu de base.

- Méthode de routine (XP V 08-059)

La gélose au chloramphénicol est supplémentée avec une solution de gentamicine à 1 mg/ml , stérilisée par filtration et ajoutée au milieu préalablement refroidi à 47°C à raison de 10ml/100ml de milieu ; uniquement dans le cas où l’on soupçonnerait la présence de contamination importante par des bactéries Gram-négatif pouvant être trouvées dans les viandes et les produits de la pêche crus.

UTILISATION

1) Ensemencement en profondeur (Norme ISO 795 et NF V 04-015)
Prendre deux boîtes de Petri stériles. Transférer dans chacune des boîtes 1 ml de l’échantillon pour essai s’il est liquide, ou 1 ml de la suspension-mère dans le cas d’autres produits.

Recommencer ces opérations avec les dilutions suivantes en prenant soin de changer de pipette entre chaque dilution décimale.

Couler dans chaque boîte de Petri, environ 15 ml de la gélose au chloramphénicol fondue préalablement et maintenue à 45°C dans un bain-marie. Le temps qui s’écoule entre la fin de la préparation des dilutions et le moment où le milieu est coulé ne doit pas excéder 15 minutes.

Mélanger soigneusement l’inoculum au milieu et laisser se solidifier les boîtes sur une surface fraîche horizontale avant d’incuber les boîtes à 25°C pendant 3, 4 et 5 jours. Compter les colonies chaque jour.

2) Ensemencement en surface – méthode de routine (Norme XP V 08-059)
Prendre une boîte de Petri contenant du milieu solide dont la surface a été préalablement séchée.
Transférer, à l’aide d’une pipette, 0,1 ml de l’échantillon pour essai s’il est liquide ou 0,1 ml de la suspension-mère pour les autres produits.
Etaler sur toute la surface du milieu à l’aide d’un étaleur stérile.
Recommencer ces opérations avec les dilutions suivantes, en prenant soin de changer de pipette et d’étaleur entre chaque dilution décimale.
Retourner les boîtes ainsi préparées et les incuber à l’étuve à 25°C pendant trois jours, quatre jours et cinq jours, avec lecture au bout de trois jours et quatre jours.

NB : Manipuler les boîtes avec précaution de façon à éviter la dispersion des spores de moisissures.

3) Méthode pour céréales, légumineuses et produits dérivés ( ISO 7698)
Peser, à 0,1 g près, la masse de la prise d’essai spécifiée au tableau suivant dans
a) le bol d’un homogénéisateur rotatif pour les produits de la catégorie 1, ou
b) un sac en plastique de Stomacher pour les produits de la catégorie 2.

catégorie 1: grains ou graines: 40 g dans 360 ml de diluant
catégorie 2: produits de mouture: 20 g dans 180 ml de diluant

Laisser en contact la prise d’essai et le diluant pendant 30 min, puis
a) ou faire fonctionner l’homogénéisateur rotatif pendant un temps suffisant pour avoir un nombre total de tours compris entre 15 000 et 20 000 ( ce temps ne doit pas excéder 2,5 minutes).
b) ou bien faire fonctionner le Stomacher pendant 2 minutes.

Préparer les dilutions . Prendre quatre boîtes de Petri stériles. Transférer dans chacune de ces boîtes, à l’aide d’une nouvelle pipette stérile, 1 ml de la dilution 10-1. Prendre quatre autres boîtes de Petri stériles et faire de même avec la dilution 10-2. Recommencer avec les dilutions suivantes.

Pour chaque groupe de quatre boîtes, couler dans deux boîtes, environ 15 ml de milieu de dénombrement pour bactéries et dans les deux autres boîtes 15 ml de gélose au chloramphénicol.
Mélanger soigneusement et laisser se solidifier sur une surface fraîche et horizontale. Préparer deux boîtes témoin de stérilité.

Retourner les boîtes de milieu et les placer à l’étuve réglée à 30°C pendant 3 jours pour la gélose nutritive et à 25°C pendant 5 jours pour la gélose au chloramphénicol.

4) méthode répression des fraudes
Prendre les précautions nécessaires pour ne pas contaminer l’échantillon par des levures.
Dans les types d’échantillon additifs, préparer la suspension mère (10-1) en pesant 20 g ± 0.1g d’échantillon dans un bol Waring Blendor. Ajouter 180 ± 1 g de peptone sel. Homogénéiser à vitesse maximale pendant 3 minutes. Diluer sans délai.
Dans les types d’échantillon pré mélangés, opérer comme ci-dessus mais en substituant la peptone sel par la peptone sel à 1% de thioacétamide.
Dans les types d’échantillon autres que les aliments minéraux, peser 50± 0.5 g d’échantillon dans un bol Waring blendor. Ajouter 450 ± 1 g de peptone sel. Homogénéiser 1 minute à la vitesse maximale. Laisser reposer 15 à 45 minutes. Homogénéiser à nouveau 2 minutes à vitesse maximale. Diluer sans délai.
Dans les types d’échantillon aliments minéraux, opérer comme ci-dessus mais en substituant la peptone sel par la peptone sel à 1% de thioacétamide.

Les levures sédimentent vite dans la suspension mère. Remettre en suspension avant d’effectuer les dilutions.
Dans le cas d’échantillons dont le titre en levure est élevé (additifs, pré mélanges), on obtient une meilleure précision en effectuant, au lieu des dilutions décimales successives, des dilutions au 1/100 et/ou au 1/1000 en utilisant des pipettes à piston.

- Additifs et pré mélanges
A partir de la suspension mère à 10-1, effectuer des dilutions successives au 1/100 et au 1/1000. Porter 0.1 ml ou 1 ml de la suspension mère dans une fiole jaugée de 100 ml à l’aide d’une pipette à piston.
Compléter à 100 ml avec de la peptone sel. Boucher à l’aide de parafilm.
Agiter par 8 retournements successifs.
Effectuer les dilutions successives nécessaires en s’aidant du tableau ci-dessous.
Changer la pointe de la pipette entre chaque dilution.

- Aliments
Effectuer une série de dilutions décimales successives
Faire une dilution au 10-2 en portant à l’aide d’une pipette de 1 ou 2 ml, 1 ml de suspension mère à
10-1 dans 9 ml de peptone sel. Agiter au vortex 4 fois successivement pendant quelques secondes.
Répéter cette opération en utilisant une nouvelle pipette à chaque nouvelle dilution décimale.


Ensemencer en se basant sur le titre déclaré en levures , au moins les dilutions suivantes :
• 1ml de dilution contenant théoriquement entre 500 et 50 UFC/ ml dans chacune des deux boîtes de Petri.
• 0,1 ml de cette même dilution (additifs et pré mélanges) ou 1 ml de la dilution décimale suivante (aliments) dans chacune des 2 autres boîtes de Petri.

Couler sans délai environ 15 ml de la gélose au chloramphénicol maintenue en surfusion à 47°± 2°C. Mélanger soigneusement sans délai et laisser se solidifier sur une surface horizontale .
Retourner les boîtes et les incuber à 35 ± 2°C pendant au moins 48 heures.

LECTURE ET EXPRESSION DES RESULTATS[/]

[u]1) Ensemencement en profondeur
Après cinq jours, retenir les boîtes contenant moins de 150 colonies. Si des parties de boîtes sont envahies par des moisissures ou s’il est difficile de compter des colonies bien isolées, retenir les comptages après 4, ou même 3 jours d’incubation. Cette particularité doit être notée dans le procès verbal d’essai.

Dans le cadre de la norme sur le dénombrement des levures et des moisissures sur les laits de conserve ne retenir que les boîtes contenant :
- moins de 150 colonies de levures,
- moins de 50 colonies de moisissures.

La distinction entre les colonies de levures et les thalles de moisissures est faite par examen macroscopique. Les levures se présentent sous forme de colonies rondes plus ou moins bombées en surface, lenticulaires en profondeur, leur contour est le plus souvent régulier, elles sont opaques. Les moisissures se présentent sous forme de colonies duveteuses et souvent pigmentées, plus ou moins étendues. Cependant dans les cas douteux, procéder à un examen microscopique des colonies : les colonies de levures sont en général constituées de cellules ovoïdes ou rondes, tandis que les thalles présentent des filaments mycéliens.

Pour la norme NF V 04-015
• le nombre de levures par gramme de lait en poudre ou par gramme de lait concentré sucré est calculé par la moyenne arithmétique du nombre de colonies dans les deux boîtes lorsqu’il existe au niveau d’une même dilution deux boîtes contenant entre 15 et 150 colonies ou une boîte contenant entre 15 et 150 colonies et l’autre moins de 15 colonies.

Si l’une des boîtes contient entre 15 et 150 colonies et l’autre plus de 150 colonies, ne retenir que la première de ces boîtes. Ne retenir ensuite que deux chiffres significatifs, en opérant de la façon suivante :
- si le nombre est inférieur à 100, l’arrondir au plus proche multiple de 5 ;
- si le nombre est supérieur à 100 et se termine par un 5, l’arrondir au plus proche multiple de 20 ;
- si le nombre est supérieur à 100 et ne se termine pas par un 5, l’arrondir au plus proche multiple de 10.

Multiplier cette valeur par l’inverse du taux de dilution correspondant.

Il existe des boîtes contenant entre 15 et 150 colonies au niveau de deux dilutions successives : calculer le nombre de levures pour chaque dilution et prendre comme résultat la moyenne arithmétique des deux valeurs obtenues sauf si le rapport de la valeur la plus forte à la valeur la plus faible est supérieur à 2 ; dans ce cas, retenir comme résultat la valeur la plus faible.

Les deux boîtes au niveau de la suspension mère contiennent moins de 15 colonies. Donner le résultat sous la forme :
- moins de 150 levures par gramme de lait en poudre,
- moins de 45 levures par gramme de lait concentré sucré.

Il n’y a pas de colonie au niveau de la suspension mère. Donner le résultat sous la forme :
- moins de 10 levures par gramme de lait en poudre.
- Moins de 3 levures par gramme de lait concentré sucré.

• le nombre de moisissures par gramme de lait en poudre ou de lait concentré sucré est donné en prenant en compte cette fois seulement le nombre de colonies de moisissures., on prendra 50 au lieu de 150 comme nombre maximum de colonies par boîte et 5 au lieu de 15 comme nombre minimum.

Pour les autres normes
Le nombre de levures et de moisissures par gramme ou par millilitre est égal à :





où
Sc est la somme des colonies sur toutes les boîtes comptées ;
n1 est le nombre de boîtes comptées à la première dilution ;
n2 est le nombre de boîtes comptées à la seconde dilution ;
d est la dilution à partir de laquelle les premiers dénombrements sont obtenus.
Arrondir le résultat obtenu à deux chiffres significatifs. Le résultat doit être exprimé par un nombre compris entre 1,0 et 9,9 multiplié par 10x , x étant la puissance appropriée de 10.

- S’il n’y a aucune colonie sur les boîtes au niveau de la suspension-mère, si le produit est d’origine solide, le nombre de levures et de moisissures par gramme de produit sera rapporté comme étant inférieur à 10.

- S’il n’y a aucune colonie sur les boîtes au niveau de l’échantillon pour essai, si le produit d’origine est liquide, le nombre de levures et de moisissures par millilitre de produit sera rapporté comme inférieur à 1.

2) Ensemencement en surface
Retenir les boîtes contenant moins de 150 colonies, au niveau de deux dilutions successives. Il faut qu’une boîte renferme au moins 15 colonies. Le calcul du nombre de levures et de moisissures par millilitre ou par gramme de produit, en temps que moyenne pondérée, s’effectue à l‘aide de l’équation suivante :





où
Sc est la somme des colonies comptées sur les deux dilutions successives,
d est le taux de dilution correspondant à la première dilution retenue.
Arrondir les résultats à deux chiffres significatifs comme dans la précédente méthode.

3) Méthode répression des fraudes
Retenir les boîtes contenant moins de 300-350 colonies. Compter soigneusement toutes les colonies de levures. Les levures se fixent souvent au plastique du fond des boîtes, en particulier à l’endroit de l’inoculum, donnant un aspect d’essaimage. Ces colonies doivent être comptées. Faire le comptage sur 4 boîtes (deux dilutions successives si possible).

Si toutes les boîtes contiennent un nombre insuffisant ou trop élevé de colonies, recommencer éventuellement le dénombrement en modifiant les dilutions ensemencées.

Calculer le nombre N d’UFC de levures par gramme à l’aide de la formule :




où
Sc est la somme des colonies comptées sur les boîtes retenues ;
v est l’équivalent du volume (ml) de la dilution d, inoculé dans les boîtes retenues ;
d est le taux de dilution correspondant à la première dilution retenue.
Exprimer le résultat par un nombre compris entre 1,0 et 9,9 multiplié par 10x où x est la puissance décimale appropriée.

Il est souhaitable d’effectuer deux essais par échantillon à partir de suspensions mères différentes et d’exprimer le résultat sous forme de leur moyenne.






Ce milieu est préconisé dans la norme AFNOR NF V 08-027- ISO 10273 concernant les directives générales pour la recherche des Yersinia enterolitica présumés pathogènes.

Le milieu CIN est un milieu d’isolement et d’identification qui permet la formation de colonies caractéristiques . La formule correspond à celle décrite par SCHIEMAN. La présence de sels biliaires, de cristal violet, d’irgasan et d’antibiotiques inhibe le développement des bactéries Gram + et la plupart des bactéries Gram -.
Le mannitol et le rouge neutre permettent une identification présomptive de Yersinia enterolitica.


FORMULE (en g/l d’eau distillée)
.
1) Milieu de base

peptone de gélatine 17.000
Peptone d’origine animale 3.000
Extrait de levure 2.000
Mannitol 20.000
Sels biliaires 1.000
Sodium pyruvate 2.000
Sodium chlorure 1.000
Magnésium sulfate heptahydraté 0.010
Sodium désoxycholate 0.500
Rouge neutre 0.030
Cristal violet 0.001
Agar 15.000



Dissoudre les composants dans l’eau en portant à ébullition.
Répartir le milieu de base dans des flacons de capacité appropriée.
Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes.

2) Solution de cefsulodine
Cefsulodine 1,5 g
Eau distillée 100 ml
Dissoudre la cefsulodine dans l’eau.
Stériliser par filtration.

3) Solution d’irgasan
Irgasan 0,4 g
Ethanol, 95% (V/V) 100 ml
Dissoudre l’irgasan dans l’éthanol extemporanément, sinon conserver la solution à environ –20°C pendant 4 semaines au maximum.

4) Solution de novobiocine
Novobiocine 0,25 g
Eau distillée 100 ml
Dissoudre la novobiocine dans l’eau.
Stériliser par filtration.

5) Milieu complet
Milieu de base 997 ml
Solution de cefsulodine 1 ml
Solution d’irgasan 1 ml
Solution de novobiocine 1 ml
Ajouter stérilement chaque solution d’antibiotique au milieu de base refroidi à environ 45°C et mélanger.

6) Hydroxyde de potassium en solution saline
Hydroxyde de potassium 0,25 g
Sodium chlorure 0,85 g
Eau distillée 100 ml

Dissoudre l’hydroxyde de potassium dans la solution saline.
Répartir dans des flacons ou des tubes.
Stériliser à 121°C pendant 15 minutes.


UTILISATION

Couler environ 15 ml de milieu complet dans des boîtes de Petri stériles. Laisser se solidifier.
Juste avant l’emploi, sécher soigneusement les boîtes de gélose, de préférence après avoir retiré le couvercle et retourné les boîtes, dans une étuve réglée entre 37°C et 55°C jusqu’à séchage de la surface de la gélose.

A partir de la culture obtenue sur milieu PSB (bouillon à la peptone, au sorbitol et aux sels biliaires) et de celle obtenue sur ITC (bouillon à l’irgasan, à la ticarcilline et au chlorate de potassium), ensemencer à l’aide d’une anse bouclée la surface d’une boîte de gélose CIN et étaler de manière à obtenir des colonies bien isolées.

Avec une pipette stérile, transférer 0,5 ml de la culture obtenue sur milieu PSB dans 4,5 ml de solution d’hydroxyde de potassium et agiter. Au bout de 20 secondes, ensemencer à l’aide d’une anse la surface d’une boîte de gélose CIN afin d’obtenir des colonies bien séparées.
Retourner les boîtes et les placer dans l’étuve à 30°C pendant 24 heures.

LECTURE

Après 24 heures d’incubation, examiner les boîtes à la loupe ou en transillumination oblique afin de rechercher la présence de colonies caractéristiques de Yersinia enterolitica.

Sur la gélose CIN, les colonies caractéristiques sont petites ( 1 mm), lisses, à centre rouge, à bords translucides et, lorsqu’elles sont observées sous transillumination oblique, sont finement granuleuses et non irisées.

Si le développement des colonies est lent, si la coloration est faible ou s’il n’y a pas de colonie caractéristique, prolonger l’incubation des boîtes jusqu’à 48 heures, puis les réexaminer.

NB : certaines bactéries utilisant le mannitol, telles que Enterobacter, Citrobacter et Serratia présentent sous forme de colonies roses pouvant être confondues avec Yersinia. Il est donc nécessaire de réaliser une identification complète par des tests biochimiques.

Le milieu au citrate de Simmons est un milieu solide utilisé pour l’identification des bacilles à Gram négatif. Il permet la recherche de l’utilisation du sodium comme source de carbone.

Seules les bactéries possédant une citrate perméase sont capables de se développer sur ce milieu. Le citrate est ensuite métabolisé en acide citrique plus trois radicaux hydroxyles.

Si l’utilisation du citrate est complète en aérobiose (formation de CO2 et d’H2O) ou fermentaire sans production d’acide carboxylique, les groupements hydroxyles libérés provoquent l’alcalinisation du milieu qui passe du vert au bleu par virage de son indicateur coloré, le bleu de bromothymol.

Il est utilisé pour le test IMViC (Indole, rouge de méthyle et Voges-Proskauer, utilisation du citrate). Il est aussi préconisé dans la norme V 08-027 (ISO 10273) pour la recherche de Yersinia enterolitica présumées pathogènes.

FORMULE (en g/l d’eau distillée)
.
Magnésium sulfate 0.20
Sodium Citrate 2.00
Sodium chlorure 5.00
Di-potassium hydrogénophosphate 1.00
Ammonium dihydrogénophosphate 1.00
Bleu de bromothymol 0.08
Agar 15.00



Mélanger et chauffer en agitant fréquemment. Laisser bouillir pendant 1 minute.
Répartir en tubes à raison de 10 ml par tube et stériliser à 121°C pendant 15 minutes.
Refroidir en position inclinée de manière à former une longue pente.


UTILISATION

Ce milieu doit être ensemencé à partir d’une culture prélevée sur milieu gélosé. En aucun cas on ne se servira d’une culture en bouillon ou en eau peptonée qui apporterait avec les germes des éléments susceptibles de fausser les résultats.
Ensemencer en surface par une strie centrale et longitudinale.
Incuber à l’étuve à 30°C ou à 37°C pendant 1 à 7 jours. Observer tous les jours.

LECTURE

Les germes citrate-positifs donnent une culture abondante avec, en général un bleuissement du milieu.
Les germes citrate-négatifs ne donnent ni culture ni bleuissement du milieu, même après plusieurs jours d’incubation.






En 1915, CLARK et LUBS démontrèrent que la famille des Enterobacteriaceae pouvait être divisée en deux groupes selon leur action sur les milieux peptonés glucosés.
Ce milieu sert à l’étude de deux réactions :
- réaction au rouge de méthyle (RM),
- réaction de Voges-Proskauer (VP).
Ces réactions sont utilisées en particulier dans la différenciation des Enterobacteriaceae (test IMViC : indole, RM, VP, utilisation du citrate) et plus particulièrement pour la différenciation à l’intérieur du groupe Escherichia coli-Enterobacter.

a) Quelques bactéries fermentent le glucose avec formation exclusive d’acide, ce qui fait tomber le pH du milieu en dessous de 4,4. D’autres traitent l’acide formé ou ses précurseurs en donnant des produits neutres, ce qui diminue très peu le pH du milieu. Cette différence dans le processus de fermentation peut être mise en évidence par le rouge de méthyle qui présente une coloration jaune au-dessus de pH 5,1 et une coloration rouge en dessous de pH 4,4.

b) De nombreux micro-organismes forment à partir du glucose de l’acétoïne (acétylméthyl-carbinol), du butanédiol-2, 3 ou du diacéthyl. La mise en évidence de ces métabolites est réalisée au moyen du réactif de O’MEARA amélioré par LEVINE et al.

Ce milieu est aussi préconisé dans la norme ISO/FDIS 6579 : 2001 (NF 08-013 concernant la méthode horizontale pour la recherche des Salmonella ainsi que dans la norme V 08-052 sur la méthode de routine pour la recherche des Salmonella. Il est utilisé pour le test IMViC (Indole, rouge de méthyle et Voges-Proskauer, utilisation du citrate).

FORMULE (en g/l d’eau distillée)
.
Peptone 7
Di- Potassium hydrogénophosphate 5
Glucose 5



Dissoudre en agitant et en chauffant le plus bas possible.
Stériliser par filtration sur membrane filtrante 0,22µ. Eventuellement stériliser par autoclavage à 110°C pendant 30 minutes.

UTILISATION[/center]
.
1) METHODE CLASSIQUE
Ensemencer 5 ml de milieu avec le germe à étudier. Incuber à 37°C et, si nécessaire, parallèlement à 22°C (Hafnia, Serratia proteomaculans, Pantœa agglomerans)

[color=violet]a) Réaction au rouge de méthyle
Après deux jours d’incubation, prélever environ 2 ml de milieu et les transvaser dans un autre tube. Y verser 1 à 2 gouttes d’une solution à 0,5 g% de rouge de méthyle dans l’alcool à 60°. Si le milieu prend :
- une teinte rouge (pH inférieur à 4,2) : réaction positive (RM +), production d’acides forts.
- une teinte jaune (pH supérieur à 6,9) : réaction négative (RM -).

b) Réaction de Voges-Proskauer
Après deux jours d’incubation, 1 ml de milieu est additionné de 0,5 ml d’une solution à 6% d’alpha naphtol dans l’alcool à 90°(réactif à conserver à l’obscurité à +4°C) et de 0,5 ml d’une solution aqueuse de soude à 16% (4N). Agiter et attendre 15 minutes.
Si la souche étudiée produit de l’acétylméthyl-carbinol (acétoïne), la présence de ce métabolite se traduit par l’apparition d’une coloration rouge en surface, pouvant diffuser dans le milieu (souche VP +).

2) METHODE RAPIDE
Répartir 0,5 ml de milieu dans un tube de 22 x 220 mm et 0,5 ml dans un tube à hémolyse. Ensemencer avec une goutte de suspension en eau physiologique du germe à étudier, titrant environ 5.108 bactéries par ml.
Après 18-24 heures d’incubation, verser dans le tube à hémolyse une goutte de solution de rouge de méthyle (lecture comme précédemment). Ajouter dans l’autre tube 0,5 ml de solution d’alpha naphtol, puis 0,5 ml de soude 4N. Porter à début d’ébullition. Retirer de la flamme et agiter pendant une minute (agitation type « Vortex »).

Coloration rouge franc : réaction VP +.

3) METHODE (Norme ISO/FDIS 6579)
Prélever, avec une öse, une fraction de culture sur boîte et l’émulsionner dans un tube stérile contenant 0,2 ml de milieu. Faire incuber à 37°C pendant 24 h  3 heures.

Après incubation, ajouter 2 gouttes de la solution de créatine, trois gouttes de la solution éthanolique de naphtol-1 et, ensuite 2 gouttes de la solution d’hydroxyde de potassium en agitant entre chaque réactif. (cf Annexes)

La formation d’une coloration rose à rouge brillant dans un délai de 15 minutes indique une réaction positive

Les recherches biochimiques complémentaires sont : la décomposition de l’urée , la décarboxylation de la lysine, la réaction à la b-galactosidase, la réaction de Voges Proskauer et la recherche de l’indole.


Il convient d’effectuer une confirmation sérologique avec sérotypage pour faire une identification définitive.







Le bouillon cerveau-coeur est un milieu liquide nutritif tamponné particulièrement adapté à la croissance des germes anaérobies et de nombreuses bactéries aérobies.

L’infusion de cœur de bœuf, de cervelle de veau et la protéose peptone sont sources d’azote, de carbone, et de vitamines. Le glucose est la source de carbone qui facilite la croissance . Le chlorure de sodium maintient la pression osmotique. Le phosphate disodique joue un rôle tampon.
Il convient à la culture des staphylocoques, entérocoques et des lactocoques..

En 1910, ROSENOW découvrit un excellent milieu pour isoler les Streptocoques par la supplémentation d’un milieu glucosé avec du tissu cervical. HAYDEN modifia la formulation de Rosenow par addition de marbre qui améliora la croissance des pathogènes dentaires. Le milieu cœur-cervelle est dérivé du milieu décrit par ROSENOW et HAYDEN dans lequel une infusion de cervelle de veau a remplacé le tissu cervical et le phosphate disodique , le tampon carbonate de calcium.

Ce milieu est préconisé dans la confirmation par la recherche de la coagulase dans la norme européenne NF EN ISO 6888-1 (V 08-014-1) concernant la méthode horizontale pour le dénombrement des staphylocoques à coagulase positive (staphylococcus aureus et autres espèces) et dans [b]la méthode de routine pour le dénombrement des Staphylocoques à coagulase positive NF V 08-057-1, dans le dénombrement de Staphylococccus aureus dans les produits laitiers secs par la technique du nombre le plus probable (FIL –IDF 60 B) dans les laits de conserve (NF V 04-015). Il est également recommandé dans la norme NF 59-105 concernant la recherche de Staphylococcus aureus dans la gélatine alimentaire.

Standard Methods for the Examination of Waster and Wastewater recommande l’infusion cœur-cervelle dans les tests de contamination fécale à streptocoques. Le National Commitee for Clinical Laboratory Standards la préconise pour la préparation de l’inoculum utilisé lors de tests d’effets antimicrobiens

La croissance des germes anaérobies ou micro-aérophiles est améliorée par l’addition de petites quantités d’agar ( environ 0,05 à 2%) au bouillon. Il permet également l'isolement et la culture des champignons pathogènes. Dans ce cas, la croissance de la flore d’accompagnement bactérienne peut être largement inhibée par l’addition de 20 U.I. de pénicilline et 40 µg de streptomycine par ml.

ROSEBURG, EPPS et CLARK ont rapporté que l’isolement et la culture d’ Actinomyces israelii sont améliorés sur infusion cœur cervelle avec 2% d’agar.
L’addition de 0,05 µg de cycloheximide et 0,5 µg/ml de chloramphénicol est recommandée pour l’isolement sélectif de champignons exigeants, surtout d’ Histoplasma capsulatum et de Blastomyces à partir d’un prélèvement contaminé.

Le bouillon cœur-cervelle additionné de 3% de chlorure de sodium est un excellent milieu pour la culture de Vibrio parahaemolyticus. L’ajout de caséine au milieu favorise la croissance de Serratia marcescens et la supplémentation de 0,7% d’agar celle d’espèces de Staphylocoques pour la production d’entérotoxines.

FORMULE (en g/l d’eau distillée)
.
Extrait déshydraté de cervelle de veau 12.5
Extrait déshydraté de cœur de bœuf 5.0
Protéose peptone 10.0
Glucose 2.0
Sodium chlorure 5.0
Disodium hydrogénophosphate 2,5



Dissoudre les composants dans l’eau et porter à ébullition.
Répartir en tubes à raison de 10 ml par tube.
Stériliser le milieu à 121°C pendant 20 minutes.
Le milieu peut être conservé plusieurs mois entre 0 et +5°C.
Ajouter 15 g d’agar si le milieu est gélosé.

UTILISATION ET LECTURE

a) Dans le cas des hémocultures, il est conseillé d'ajouter 0,05 g d'acide para-aminobenzoïque (inhibiteur des sulfamides éventuelles) et 1,00 g d'agar par litre de bouillon (pour maintenir l’état réduit et faciliter l’examen microscopique), que l'on portera à ébullition quelques minutes. Il est également nécessaire d'ajouter aseptiquement de la pénicillinase de manière à inhiber l'action de la pénicilline éventuellement présente dans le sang concerné. Chaque tube de 20 ml de bouillon sera alors inoculé par environ 2,5 ml de sang. Après agitation douce, les tubes seront incubés à 37°C jusqu'à apparition d'une culture.

b) Dans le cas de culture d'anaérobies, les milieux seront régénérés pendant 20 minutes au bain-marie bouillant de manière à chasser l'oxygène dissous, puis refroidis rapidement en évitant toute agitation.

c) Dans le cas de culture de certains champignons, il est nécessaire d'ajouter 2 % d'agar au bouillon :
* Isolement et subcultures d'Actinomyces israelii et bovis
* Culture d'Histoplasma capsulatum par addition de 10 % de sang défibriné stérile de cheval.
• Isolement et culture d'Histoplasma capsulatum et Coccidioïdes immitis par addition de 20 microg de pénicilline et 40 microg de streptomycine par ml de bouillon.

- Recherche de la coagulase
Pour l’évidence de la coagulase chez Staphylococcus, le bouillon cœur-cervelle est utilisé en repiquant, à l’aide d’un fil stérile, une partie de chaque colonie sélectionnée sur milieu Baird Parker. Porter les tubes à l’étuve à 35 ou 37°C durant 20 à 26 heures.

Ajouter stérilement 0,1 ml de chaque culture à 0,3 ml de plasma de lapin (à moins que d’autres quantités soient spécifiées par le fabricant) dans des tubes à hémolyse stériles.
Si l’on ne peut se procurer du plasma de lapin déshydraté, diluer un plasma de lapin frais et stérile à 1 volume pour 3 volumes d’eau stérile. Si du citrate de potassium ou de sodium a été utilisé comme anticoagulant, ajouter une solution d’EDTA de façon à obtenir du plasma à 0 ,1% d’EDTA.

Incuber à l’étuve ou mieux au bain-marie à 35°C ou à 37°C.
Examiner la coagulation du plasma après 4 à 6 heures en inclinant doucement le tube.
Considérer que la réaction à la coagulase est positive quand le coagulum occupe plus de la moitié du volume initialement occupé par le liquide. Si le test est négatif réexaminer après 24h d’incubation

A titre de contrôle, ajouter 0,1 ml de bouillon cœur-cervelle stérile à la quantité recommandée de plasma de lapin et faire incuber sans ensemencement. Pour que la réaction soit valable, le plasma du tube témoin ne devra pas montrer de signes de coagulation

EXPRESSION DES RESULTATS

a) cas des produits laitiers secs (FIL-IDF 60B)
Pour chaque dilution du milieu de culture sélectif liquide (bouillon de Giolitti et Cantoni) ensemencé , noter le nombre de tubes dans lesquels la présence de Staphylococcus aureus a été confirmée. Désigner ceux-ci comme tubes positifs.

b) méthode de référence (ISO 6888-1)
- Calcul du nombre a de staphylocoques à coagulase positive pour chaque boîte retenue :
Calculer , pour chacune des boîtes , le nombre a de staphylocoques à coagulase positive identifiés, selon l’équation suivante :




où
Ac est le nombre de colonies caractéristiques soumises au test de la coagulase ;

Anc est le nombre de colonies non caractéristiques soumises au test de la coagulase ;

bc est le nombre de colonies caractéristiques qui ont répondu positivement au test de la coagulase ;

bnc est le nombre de colonies non caractéristiques qui ont répondu positivement au test de la coagulase ;

cc est le nombre total de colonies caractéristiques repérées sur la boîte.

cnc est le nombre total de colonies non caractéristiques repérées sur la boîte.

Arrondir à un nombre entier

- calcul du nombre N de staphylocoques à coagulase positive identifiés présents dans la prise d’essai




où

a est le volume de l’inoculum appliqué à chaque boîte, en millilitres ;
n1 est le nombre de boîtes retenues à la première dilution ;
n2 est le nombre de boîtes retenues à la seconde dilution ;
d est le taux de dilution correspondant à la première dilution retenue (la suspension mère est une dilution)

Arrondir à deux chiffres significatifs les résultats obtenus et noter le résultat comme étant le nombre de staphylocoques à coagulase positive par millilitre ou par gramme.

- estimation des petits nombres
• Si les deux boîtes, au niveau de l’échantillon pour essai (produits liquides) ou de la suspension mère (autres produits) contiennent chacun moins de 15 colonies identifiées, exprimer le résultat comme suit :
• pour les produits liquides




où
a est la somme des colonies de staphylocoques à coagulase positive identifiées sur les deux boîtes retenues ;
V est le volume étalé sur chaque boîte

• pour les autres produits





où
a est la somme des colonies de staphylocoques à coagulase positive identifiées sur les deux boîtes retenues ;
d est le taux de dilution de la suspension mère
V est le volume étalé sur chaque boîte

•Si les deux boîtes, au niveau de l’échantillon pour essai ( produits liquides) ou de la suspension mère (autres produits), ne contiennent aucune colonie de staphylocoque à coagulase positive et si l’ensemencement est effectué avec 0,1 ml d’échantillon, exprimer le résultat comme suit :
- moins de 10 staphylocoques à coagulase positive par millilitre (produits liquides),
- moins de 10/d staphylocoques à coagulase positive par gramme (autres produits)où d est le taux de dilution de la suspension mère
Si l’ensemencement a été effectué avec 1 ml d’échantillon, exprimer le résultat comme suit :
- moins de 1 staphylocoque à coagulase positive (produits liquides),
- moins de 1/d staphylocoques à coagulase positive par gramme (autres produits).


c) recherche dans la gélatine alimentaire (NF V 59-105)
Selon la conclusion de l’analyse, indiquer le résultat sous la forme :
Présence ou absence de Staphylococcus aureus dans 0,1 g de gélatine.







Ce milieu est un milieu sélectif liquide permettant la culture des « coliformes » à 30°C applicable à la gélatine alimentaire mais également aux gélatines destinées à d’autres usages, ainsi qu’à la recherche des « coliformes fécaux » à 44,5°C dans ces mêmes gélatines.

Il est préconisé dans la norme NF V 59-102 qui est une adaptation au cas particulier des gélatines, de la norme des directives générales NF V 08-016 qui traite des coliformes se développant à 30°C ; et dans la norme NF V 59-103 qui est une adaptation de la norme des Directives générales NF V 08-015 qui traite des coliformes fécaux se développant à 44,5°C.

FORMULE

pour la simple concentration SC
Lactose 10.000g
Sodium glutamate 6.350g
Sodium formate 0.250g
L cystine 0.020g
L (-) acide aspartique 0.024g
L (+) arginine 0.020g
Thiamine 0.001g
Acide nicotinique 0.001g
Acide pantothénique 0.001g
Magnesium sulfate, 7 H2O 0.010g
Ammonium fer (III) citrate 0.010g
Calcium chlorure 0.001g
Bi-potassium hydrogénophosphate 0.900g
Pourpre de Bromocrésol 0.010

Doubler toutes les valeurs pour la double concentration

Ammonium chlorure à 2,5 g/l (SC) ou à 5g/l (DC) qsp 1000ml



Dissoudre les composants dans la solution de chlorure d’ammonium.

- cas des « coliformes » à 30°C
Répartir le milieu dans des fioles à raison de 50 ml par fiole
Ajouter dans chaque fiole une cloche de Durham.

- cas des « coliformes fécaux » à 44,5°C
Répartir le milieu double concentration dans des fioles à raison de 100 ml par fiole.
Ajouter dans chaque fiole deux cloches de Durham

Répartir le milieu simple concentration dans des tubes à essai à raison de 10 ml par tube contenant chacun une cloche de Durham.

Stériliser à l’autoclave à 116°C pendant 10 minutes. Laisser refroidir jusqu’à température ambiante.
Les cloches ne doivent pas contenir d’air, sinon retourner la fiole avant emploi de manière à laisser s’échapper l’air inclus dans la cloche.


UTILISATION ET LECTURE

A) « Coliformes » à 30°C
Prendre une fiole contenant 50 ml de milieu et transférer stérilement 10 ml de la solution d’essai.

Mélanger soigneusement l’inoculum au milieu de culture en agitant doucement par des mouvements circulaires et en évitant l’entrée d’air dans les cloches.

Placer la fiole pendant 48 heures dans l’étuve réglée à 30°C.

Après la période d’incubation, examiner la fiole pour noter la présence éventuelle de gaz dans la cloche de Durham.
La présence de gaz, toujours accompagnée d’une abondante culture de microorganismes traduite par un louchissement et/ou un jaunissement du milieu de culture, correspond à la présence d’au moins un « coliforme » dans la quantité de gélatine ensemencée.

• Expression des résultats
- S’il n’y a aucun dégagement gazeux dans la cloche, donner les résultats sous la forme :
Absence de « coliformes » obtenus à 30°C dans 1 g de gélatine.

- S’il y a un dégagement gazeux dans la cloche, donner le résultat sous la forme
Présence de « coliformes » obtenus à 30°C dans 1 g de gélatine.

B) « Coliformes fécaux » à 44,5°C
Préparer la solution d’essai comme ci-dessus. Prendre une fiole contenant 100 ml de milieu et deux cloches de Durham et y transférer stérilement 100 ml de la solution d’essai à l’aide d’une éprouvette.

Mélanger soigneusement l’inoculum en agitant doucement en évitant toute entrée d’air dans les cloches.

Placer la fiole pendant 48 heures dans un bain d’eau réglé à 41,5°C.
A l’issue du temps d’incubation, examiner la présence éventuelle de gaz dans les cloches.

S’il y a un dégagement gazeux dans l’une ou les deux cloches, repiquer la culture dans un milieu simple concentration muni d’une cloche de Durham.
Incuber à 44,5°C dans un bain-marie pendant 48 heures.

Après la période d’incubation, noter la présence ou l’absence de « coliformes fécaux » dans la quantité de gélatine ensemencée.

• Expression des résultats
- s’il n’y a aucun dégagement gazeux dans les cloches de Durham de la fiole, donner les résultats sous la forme :
Absence de « coliformes fécaux » dans 10 g de gélatine.
- s’il y a un dégagement gazeux dans les cloches de Durham de la fiole mais absence de dégagement gazeux dans le tube, donner le résultat sous la forme :
Absence de « coliformes fécaux » dans 10 g de gélatine

- - s’il y a un dégagement gazeux dans les cloches de Durham de la fiole et dégagement gazeux dans le tube, donner le résultat sous la forme :
Présence de « coliformes fécaux » dans 10 g de gélatine

- - s’il y a un dégagement gazeux dans les cloches de Durham de la fiole et dégagement gazeux dans le tube, donner le résultat sous la forme :
Présence de « coliformes fécaux » dans 10 g de gélatine

L’agar Columbia dû à ELLNER et coll. (1966) constitue un milieu de base de grande valeur à utilisation multiple. Par addition de sang, d’agents sélectifs ou de produits accélérateurs de croissance, il est possible de préparer une quantité de milieux nutritifs spéciaux.

La gélose Columbia est conforme à la norme NF V 08-405 (décembre 1986) relative à la recherche de Clostridium thermophiles dans les conserves. Elle est utilisée comme milieu de confirmation pour la mise en évidence du caractère anaérobie.

Elle constitue en outre :

- Un excellent milieu de base pour la réalisation d’une gélose au sang selon les conditions habituelles. Ce milieu est recommandé pour la culture des Streptocoques, Staphylocoques, Pneumocoques, Listeria et Erysipelothrix. Les colonies de ces germes sont plus volumineuses que sur les milieux usuels.

- Un milieu sélectif pour Cocci Gram +, Listeria, Erysipelothrix. Si l’on désire isoler ces souches à partir de produits contaminés, il est recommandé d’utiliser un mélange Acide Nalidixique-Colimycine. La presque totalité des germes Gram – et les Bacillus sont inhibés.

- Un milieu pour l’isolement de germes anaérobie. Après addition de sang, cyclosérine et cefoxitine, la gélose Columbia convient également à l’isolement de germes anaérobies en surface. Elle peut être utilisée comme base pour la réalisation du milieu de Willis destiné à l’identification des Clostridium.

- Un milieu de base sans enrichissement qui permet, utilisé sans addition de sang, la croissance de Brucella abortus, Yersinia pestis, Clostridium perfringens et de toutes les Entérobactéries.

- Un milieu pour l’isolement sélectif des Campylobacter. Après addition de sang de mouton (5%) et d’un mélange inhibiteur contenant trois antibiotiques (la céfopérazone, la vancomycine et l’amphotéricine, 32, 10, 3 mg/l respectivement), la gélose Columbia permet l’isolement sélectif de Campylobacter jejuni. Ce milieu est recommandé dans la méthode horizontale de recherche des Campylobacter thermotolérants NF V 08-026 (ISO 10272) comme milieu de base dans la gélose KARMALI et le milieu de BUTZLER modifié.

Les différentes peptones du milieu sont sources de carbone, d’azote d’acides aminés et de vitamines. La peptone trypsique de cœur de bœuf apportent un supplément d’acides aminés. L’amidon favorise la croissance des germes exigeants tels que Neisseria et favorise les réactions hémolytiques de quelques Streptocoques. Le chlorure de sodium maintient la pression osmotique du milieu.

FORMULE (en g/l d’eau distillée)
.
Tryptone 5
Peptone pepsique 5
Hydrolysat de peptones animale et végétale 10
Peptone trypsique de cœur 3
Amidon 1
Sodium chlorure 5
Agar 10 à 15



UTILISATION ET LECTURE

Elles sont différentes suivant le milieu complet utilisé et le but recherché.

- Dans le cadre de la norme sur la recherche des Clostridium thermophiles dans les conserves (NF V 08-405), ensemencer en stries, avec une öse, à partir de chaque tube de culture en milieu liquide, ( Rosenow cystéiné ou bouillon glucosé) la surface d’une gélose Columbia. Préparer ainsi quatre boîtes par milieu de culture liquide.
Placer deux boîtes ainsi ensemencées, à l’endroit, dans une jarre pour la culture en anaérobiose et faire incuber à 55°C. Observer chaque jour, sans ouvrir la jarre, la présence ou l’absence de colonies. En l’absence de développement, prolonger l’incubation pendant 4 jours.

Placer les deux autres boîtes témoins ensemencées à l’étuve et faire incuber en aérobiose à 55°C. En l’absence de culture, prolonger l’incubation quatre jours.

Dans le cas ou il y a à la fois culture en aérobiose et anaérobiose, repérer selon les types morphologiques isolés, les colonies se développant en anaérobiose.

Ensemencer par stries et en double, avec l’öse, une colonie isolée de chaque type morphologique, à la surface d’une gélose Columbia.

Faire incuber à 55°C, une boîte en aérobiose et l’autre en jarre anaérobiose. En l’absence de croissance bactérienne prolonger l’incubation 4 jours.

INTERPRETATION : se reporter à Rosenow cystéiné ou bouillon glucosé.

- Dans le cadre de la norme sur la méthode horizontale pour la recherche des Campylobacter thermotolérants (NF V 08026), ensemencer à l’aide d’une anse bouclée la surface d’une gélose Columbia au sang avec chaque suspension sur Bouillon Brucella, retenue lors de la sélection des colonies pour confirmation, afin de permettre le développement de colonies bien isolées.

Incuber les boîtes ensemencées à 42°C, en atmosphère microaérophile, pendant 24 heures et utiliser les cultures pures pour les essais biochimiques ultérieurs.



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Dissoudre les composants en portant à ébullition quelques minutes.
Ajuster le pH, répartir le milieu de culture en tubes à raison de 15 ml/ tube ou en flacon à raison de 100 ml/ flacon.
Stériliser à 121°C pendant 15 minutes.
Juste avant l’emploi, faire fondre le milieu de culture dans un bain-marie d’eau bouillante. Laisser refroidir à environ 45°C et couler en boîtes de Petri.

L’ion cyanure CN-, inhibiteur classique de la voie des cytochromes, bloque partiellement la respiration bactérienne. La croissance ne sera possible que si elles peuvent respirer par une autre voie. Cette recherche est surtout intéressante pour la différenciation des entérobactéries.

Il est également préconisé dans la norme NF V 04-015 relative à la recherche des Salmonella dans les laits de conserve.

FORMULE (en g/l d’eau distillée)
Peptone pancréatique de caséine 10.00
Sodium chlorure 5.00
Sodium dihydrogénophosphate anhydre 5.63
Potassium dihydrogénophosphate 0.22
Agar 1,00


Dissoudre les composants dans l’eau à ébullition. Ajuster le pH.
Stériliser à l’autoclave pendant 20 min à 121° C.

1)Solution de cyanure de potassium
A manipuler avec précaution en raison de son extrême toxicité (par exemple : système automatique de distribution).

Cyanure de potassium 0,5 g
Eau 100 ml

Utiliser une fiole jaugée de 100 ml. Dissoudre le cyanure de potassium dans l’eau.
Ne pas stériliser.

2)MILIEU COMPLET
Au moment de l’emploi, ajouter 1,5 ml de solution de cyanure de potassium à 100 ml de milieu de base.
Répartir à raison de 1 ml par tube de 120 x 12.
Ce milieu peut être conservé jusqu’à un mois à +4°C.


UTILISATION

Ensemencer 1 ml de milieu avec trois anses de culture de 18-24 heures en bouillon (à défaut une suspension assez dense de bactéries en eau physiologique). Faire des témoins avec des bactéries KCN + et KCN -.
Effectuer un contrôle de croissance avec du milieu exempt de cyanure.


LECTURE

Les souches qui donnent un trouble bactérien sont dites KCN-positives ; à l’opposé des KCN - où le milieu reste limpide.

Après utilisation, oxyder le surplus du milieu au cyanure par ajout d’hypochlorite alcalin (eau de Javel), puis jeter.

Les Salmonella ne poussent pas en milieu avec cyanure de potassium