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BAIRD-PARKER Gélose

Le dénombrement des Staphylococcus aureus, en bactériologie alimentaire est fondé sur la mise en évidence de colonies caractéristiques sur milieu spécifique, avec présence d’une enzyme particulière, la coagulase. D’autres Staphylocoques autre que Staphylococcus aureus peuvent posséder cette enzyme, aussi nous parlons maintenant de dénombrement de Staphylocoques à coagulase positive.

Ce milieu hautement sélectif a été réalisé en 1962 par BAIRD-PARKER pour l’isolement et le dénombrement des souches des Staphylocoques à coagulase positive. En 1964, SMITH et BAIRD-PARKER montrèrent que l’addition de sulfaméthazine au milieu permettait d’inhiber la croissance des Proteus ; puis en 1971, TARDIO et BAER observèrent que parmi 18 milieux d’isolement sélectif testés, le milieu de Baird-Parker était moins inhibiteur que le milieu Vogel-Johnson antérieurement utilisé de façon fréquente.


Il est recommandé en vue de la détermination des seuils de tolérance bactériologiques par la United States Pharmacopeial Convention et la FDA, et en vue de la Méthode horizontale pour le dénombrement des staphylocoques à coagulase positive (Staphylococcus aureus et autres espèces) normes NF EN ISO 6888-1 : 1999 ( V08-014-1), V 04-015 ( microbiologie des laits de conserve), V 08-057-(méthode de routine avec confirmation des colonies), V 59-105 (recherche dans la gélatine), FIL 60B (produits laitiers secs)].

Ce milieu contient de la tryptone et de l’extrait de viande qui apportent sources de carbone et d’azote pour la croissance bactérienne. L’extrait de levure apporte un complexe vitaminique stimulateur de croissance. Le chlorure de lithium, le tellurite de potassium et une forte concentration de glycine inhibent la croissance de la flore microbienne gênante tout en respectant la prolifération des Staphylocoques. En outre, le pyruvate et la glycine de la formule agissent comme des accélérateurs de croissance pour les Staphylocoques. Le tellurite et le jaune d’œuf permettent la différenciation des Staphylocoques coagulase-positifs qui donnent naissance à des colonies convexes, noires (coloration due à la transformation du tellurite en tellure ) et brillantes. Ces dernières sont également entourées par un halo clair caractéristique résultant de l’hydrolyse des lipoprotéines de l’œuf.



FORMULE (en g/l d’eau distillée)

Pour améliorer la reproductibilité des résultats, il est recommandé d’utiliser, pour la préparation du milieu, des composants de base déshydratés ou des milieux complets déshydratés et, pour l’émulsion de jaune d’œuf, une préparation commerciale. Les instructions du fabricant doivent être suivies scrupuleusement.

Les produits chimiques utilisés doivent être de qualité analytique reconnue.
L’eau utilisée doit être de l’eau distillée ou déminéralisée, exempte de substances susceptibles d’inhiber la croissance des Staphylocoques dans les conditions de l’essai.

Digestat pancréatique de caséine 10
Extrait de levure 1
Extrait de viande 5
L-Glycine 12
Sodium pyruvate 10
Lithium Chlorure 5
Agar 20



Faire bouillir jusqu’à dissolution complète.
Si nécessaire, ajouter 27,5 ml de solution de sulfaméthazine (sulfamidine). La sulfaméthazine est un inhibiteur de la croissance de Proteus.
Répartir le milieu ; par quantités de 90 ml dans des flacons de 300 ml.
Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes.
Laisser refroidir jusqu’à 50°C environ puis ajouter stérilement 5 ml d’une émulsion de jaune d’œuf et 1ml d’une solution de tellurite de potassium à 1%. Mélanger soigneusement après chaque addition.

Le milieu peut être conservé 1 mois entre 0 et +5°C.

1) Solution de tellurite
Potassium tellurite 1 g
(trioxotellurate dipotassique)
Eau distillée 100 ml
Dissoudre le tellurite de potassium dans l’eau, en chauffant le moins possible.
Stériliser par filtration.
La solution peut être conservée plusieurs mois entre 0 et +5°C, deux mois à température ambiante.

2) Solution de sulfaméthazine
Sulfaméthazine 0,2 g
Solution d’hydroxyde de sodium à 0,1 mol/l 10 ml
Eau distillée q.s.p. 1000 ml
Dissoudre la sulfaméthazine dans la solution d’hydroxyde de sodium. Compléter à 100 ml avec de l’eau.

3) Emulsion de jaune d’œuf
A défaut de préparation commerciale, utiliser des œufs frais de poule, à coquille intacte.
Stériliser la coquille à l’éthanol à 70° (V/V) pendant 30 s, laisser s’évaporer et casser l’œuf dans une boîte de Petri. Séparer le blanc du jaune, mettre ce dernier dans 80 ml d’eau distillée stérile (flacon à col large).
Porter le mélange dans un bain-marie à 47°C pendant 2 h et entreposer à +4°C pendant 18 à 24 h pour permettre au précipité de se former.
Recueillir aseptiquement l’émulsion surnageante.
L’émulsion peut être gardée 72 heures au maximum entre 0 et +5°C.

NB : La solution de tellurite et l’émulsion de jaune d’œuf peuvent être préparées en mélange. Ce mélange peut être conservé plusieurs mois à +4°C.

UTILISATION

La gélose de Baird-Parker peut servir à isoler les cultures obtenues dans un milieu d’enrichissement (milieu liquide de Chapman), ou à dénombrer les Staphylocoques par étalement en surface.

Couler 15 à 20 ml de milieu complet, refroidi à environ 45°C, dans des boîtes de Petri stériles et laisser se solidifier.
Les boîtes peuvent être conservées, avant séchage, 24 heures au maximum entre 0 et +5°C.

Sécher les boîtes pendant 20 minutes, de préférence couvercle enlevé et dans une étuve avec UV réglée à 50 +/- 1°C.

Deux techniques de dénombrement peuvent être utilisées : la méthode de référence (NF EN ISO 6888-1 ; octobre 1999) ou une variante de cette technique appliquée dans la méthode de routine (V 08-057-1 ; nov. 1994) :

a) Technique des petits nombres
S’il est souhaitable pour certains produits de procéder à des dénombrements de petits nombres de Staphylocoques, les limites de la recherche peuvent être augmentées d’une puissance de 10, en ensemençant 1 ml de l’échantillon pour essai s’il est liquide, ou 1 ml de la suspension mère pour les autres produits.
Répartir l’inoculum, soit à la surface de trois boîtes de milieu gélosé (90 mm), soit à la surface d’une grande boîte de 140 mm. Dans les deux cas, effectuer ces opérations en double, de façon à avoir deux grandes boîtes ou six petites boîtes.

b) Méthode de référence (ISO 6888-1)
Transférer, avec une pipette stérile, 2 fois 0,1 ml de l’échantillon pour essai, s’il est liquide, ou 0,1 ml de la suspension mère (dilution 10-1) pour les autres produits, à la surface de deux boîtes de milieu gélosé, respectivement.
Répéter l’opération, si nécessaire avec les dilutions suivantes.

c) Méthode de routine (NF V08-057-1)
C’est une méthode simplifiée par rapport aux méthodes de référence précédentes.
Le dénombrement s’effectue sur une seule boîte (diamètre 90 mm) de Baird Parker au lieu de deux.

d) Laits de conserve (NF V 04-015)
Prendre deux boîtes de Petri de 140 mm contenant le milieu gélosé. Transférer aseptivement à la surface de chacune d’elles au moyen d’une pipette de 1 ml stérile, 1 ml de la suspension mère (1/10 pour les laits en poudre, 1/3 pour les laits concentrés sucrés).
Prendre deux boîtes de Pétri de 90 mm contenant le milieu gélosé. Transférer aseptiquement à la surface de chacune d’elles au moyen d’une pipette de 0,1 ml stérile, 0,1 ml de la suspension mère.
Prendre deux autres boîtes de Petri de 90 mm contenant le milieu gélosé. Transférer aseptiquement comme ci-dessus 0,1 ml de la dilution au 1/10 de la suspension mère.
Poursuivre l’opération avec les dilutions suivantes si nécessaire.

e) Gélatine (NF V 59-105)
A partir du tube de bouillon lactosé hypersalé incubé, ensemencer par stries, une anse du contenu à la surface du milieu Baird Parker coulé en boîte de Petri. Retourner la boîte.

f) Produits laitiers secs (FIL 60B)
La méthode utilisée dans ce cas est une technique du nombre le plus probable.
A partir des tubes de bouillon de Giolitti et Cantoni présentant un noircissement ou un précipité noir, repiquer sur milieu Baird parker.
Pour cela, ôter le bouchon de gélose à la spatule stérile. Resuspendre la culture et avec une anse stérile étaler environ 1µl sur la surface de la gélose.

Dans tous les cas, étaler soigneusement l’inoculum le plus rapidement possible à la surface du milieu. Utiliser un râteau stérile. Laisser sécher les boîtes avec leur couvercle durant environ 15 min à la température ambiante.

Retourner les boîtes et les incuber durant 24  2 h puis les réincuber 24  2 h dans l’étuve à 35 ou à 37°C.

LECTURE

La réduction du tellurite en tellure colore la colonie en noir. L’émulsion de jaune d’œuf (apport protéique) sert à révéler une activité protéasique (halo clair autour de la colonie). Une éventuelle activité phospholipasique, plus tardive, se traduira par une zone de précipitation dans le halo (le jaune d’œuf étant également une source de lécithine).
Après 24 à 26 heures d’incubation, compter les colonies caractéristiques éventuellement présentes.

Incuber à nouveau toutes les boîtes durant 22 à 24 h supplémentaires et marquer les nouvelles colonies caractéristiques(C) ainsi que les colonies non caractéristiques (NC) . Les colonies caractéristiques sont noires ou grises, brillantes et convexes (1 à 1,5 mm de diamètre après 24 h d’incubation et 1,5 à 2,5 mm de diamètre après 48 h d’incubation) et entourées d’une zone claire qui peut être partiellement opaque. Après 24h d’incubation, peut apparaître dans cette zone claire un anneau opalescent immédiatement au contact des colonies.

Les colonies non caractéristiques sont semblables en apparence, mais sont dépourvues de zone claire. Les colonies non caractéristiques sont souvent constituées de souches de Staphylocoques à coagulase positive contaminant les produits laitiers. Elles ne sont pas produites fréquemment par des souches de Staphylocoques à coagulase positive qui contaminent les autres produits.

Si 1 ml d’inoculum est réparti sur trois boîtes, effectuer les opérations de dénombrement sur l’ensemble de ces boîtes comme s’il s’agissait d’une seule boîte. Dans ce cas, retenir toutes les boîtes qui contiennent des colonies caractéristiques et non caractéristiques.

Ne retenir pour le dénombrement que les boîtes renfermant au maximum 300 colonies dont 15 à 150 colonies caractéristiques et/ou non caractéristiques. Choisir, en vue de la confirmation, 5 colonies caractéristiques s’il n’y a que des colonies caractéristiques ou 5 colonies non caractéristiques s’il n’y a que des colonies non caractéristiques, ou 5 colonies caractéristiques et 5 colonies non caractéristiques si les 2 types sont présents à partir de chaque boîte.

Pour les boîtes de 140 mm le nombre total de colonies comptées doit être compris entre 1 et 250 (NF V 04-015). D’autre part, pour le dénombrement dans les laits de conserve, seront prises en compte les colonies de type I : noires, brillantes et convexes et entourées d’une zone transparente, parfois entourées d’un anneau opalescent ; les colonies de type II dépourvues de zone transparente et les colonies de type III qui peuvent être entourées de zone transparente, ont une couleur moins noire, un aspect mat et une texture sèche.
Sélectionner pour confirmation, trois colonies typiques et/ou atypiques, selon le cas, sur chaque boîte (colonies présumées de Staphylococcus aureus).

S’il y a moins de 15 colonies caractéristiques et/ou non caractéristiques sur les boîtes ensemencées, retenir toutes les colonies.

A l’aide d’un fil d’ensemencement droit, prélever une partie de chaque colonie sélectionnée et l’ensemencer dans un tube de bouillon cœur cervelle afin de réaliser ultérieurement le test à la coagulase.


LIMITES D’UTILISATION


- Certaines souches n’appartenant pas à l’espèce Staphylococcus aureus, en particulier Staphylococcus saprophyticus peuvent également être entourées d’un halo d’éclaircissement.

- D’autres micro-organismes que les Staphylocoques peuvent se développer sur le milieu de Baird Parker. Il s’agit des groupes suivants :
• Cocci Gram + : genre Enterococcus, Listeria
• Bacilles Gram - : genre Proteus, Pseudomonas
• Levures
Parmi ces micro-organismes, aucun ne produit habituellement de zone d’éclaircissement autour de la colonie.

- La recherche de la coagulase libre n’est pas totalement spécifique de Staphylococcus aureus. L’identification d’espèce ne peut être déterminée avec certitude que par la combinaison de plusieurs tests (coagulase libre, protéine A, clumping factor, thermonucléase) ou bien à l’aide d’une galerie d’identification.

BAIRD-PARKER+ R.P.F. Gélose(Rabbit Plasma Fibrinogen)

La gélose Baird-Parker avec RPF (Rabbit Plasma Fibrinogen) sert pour le dénombrement sans confirmation des Staphylocoques à coagulase positive. Ce produit est exclusivement réservé au contrôle microbiologique des produits alimentaires. Ce milieu est fourni prêt à l’emploi par DIFCO.

Pour réaliser le dénombrement des Staphylocoques à coagulase positive, deux méthodes sont disponibles. La méthode la plus ancienne fait appel à un milieu sélectif, le milieu Baird Parker ; les colonies suspectes sont ensuite confirmées par la recherche de la présence de la coagulase.

Une méthode plus récente, dérivée de la première, a été décrite : le milieu sélectif, proche dérivé du milieu de Baird Parker, contient du plasma de lapin, ce qui permet de mettre en évidence la coagulase directement sur le milieu sélectif. Cette technique est décrite dans la norme FIL 145 (1990) et dans la méthode de routine AFNOR V08-057- 2 et la norme européenne NF EN ISO 6888-2 relative à la méthode horizontale pour le dénombrement des staphylocoques à coagulase positive (par la technique utilisant le milieu gélosé au plasma de lapin et au fibrinogène).

Le supplément RPF contient du plasma de lapin, du fibrinogène de bœuf, permettant de mettre en évidence l’activité de la coagulase ; et un inhibiteur de trypsine pour éviter la fibrinolyse totale ou partielle des halos formés autour des colonies à coagulase positive.


Dans les deux cas, pour identifier un risque réel présent dans un aliment contenant des Staphylocoques à coagulase positive, le dénombrement seul de ces derniers ne suffit pas. En effet tous les Staphylocoques à coagulase positive ne synthétisent pas d’entérotoxines. Il sera nécessaire de rechercher la présence d’entérotoxine dans l’aliment, ou de vérifier après culture si la souche trouvée est entérotoxinogène.

FORMULE (en g/l d’eau distillée)

Ce milieu gélosé au plasma de lapin et fibrinogène est préparé avec le milieu basé sur la formule de H.J. BECKERS (1984), la sulfaméthazine ne doit pas être ajoutée.


Peptone 10
Extrait de levure 1
Extrait de viande 5
Glycine 12
Sodium pyruvate 10
Lithium Chlorure 5
Agar 12.5



1) Solution de fibrinogène bovin
Fibrinogène bovin 5 à 7 g *
Eau stérile 100 ml
* Selon la pureté du fibrinogène
En opérant aseptiquement, dissoudre le fibrinogène bovin dans l’eau, juste avant l’utilisation.

2) Solution de plasma de lapin et d’inhibiteur de trypsine
Plasma de lapin avec EDTA pour coagulase 30 ml
(plasma coagulase EDTA)
Inhibiteur de trypsine 30 mg
Eau distillée stérile 30 ml
En opérant aseptiquement, dissoudre les composants dans l’eau, juste avant utilisation.

En opérant aseptiquement, dissoudre les composants dans l’eau, juste avant utilisation.

3) Milieu complet
Milieu de base 90,00 ml
Solution de tellurite de potassium 0,25 ml
Solution de fibrinogène bovin 7,50 ml
Solution de plasma de lapin et d’inhibiteur de trypsine 5,00 ml
Faire fondre le milieu de base, puis le laisser refroidir à environ 47°C dans un bain-marie.
Ajouter les trois solutions, préalablement réchauffées à 47°C dans le bain d’eau, en mélangeant bien après chaque addition, et en opérant de façon aseptique.

UTILISATION

Il est possible de travailler suivant un ensemencement en profondeur (avec 1 ml) ou en surface (avec 0,1 ml) selon les méthodologies habituelles. Dans le cadre de la norme AFNOR V 08-057-2, il est préconisé un ensemencement en profondeur sur une seule boîte de Pétri par dilution.

Couler 10 ml de milieu gélosé dans les boîtes ensemencées avec le produit liquide à analyser ou la suspension-mère pour d’autres produits, ainsi que dans les boîtes contenant les dilutions décimales successives des deux produits.

Mélanger soigneusement l’inoculum au milieu de culture et laisser solidifier.
Après solidification complète, retourner les boîtes et les incuber à l’étuve à 37°C pendant 18 à 24 h et, si nécessaire, réincuber 18 à 24 h.

LECTURE

Les colonies de Staphylocoques à coagulase positive apparaissent entourées d’un halo opaque. Elles sont le plus souvent de couleur gris noir.
Retenir les boîtes contenant 300 colonies au maximum dont 100 colonies caractéristiques au niveau de deux dilutions successives. Il faut qu’une boîte contienne au moins 15 colonies caractéristiques.



EXPRESSION DES RESULTATS

1) Cas général
Calculer le nombre N de Staphylocoques à coagulase positive présents par millilitre ou par gramme de produit, en temps que moyenne pondérée, à partir de deux dilutions successives à l’aide de l’équation suivante :





où
SC est la somme des colonies de staphylocoques caractéristiques comptées sur l’ensemble des boîtes retenues ;
V est le volume de l’inoculum appliqué à chaque boîte en ml ;
n1 est le nombre de boîtes retenues à le première dilution ;
n2 est le nombre de boîtes retenues à la seconde dilution ;
d est le taux de dilution correspondant à la première dilution retenue.

Arrondir les résultats calculés à deux chiffres significatifs. Pour cela, si le dernier chiffre est inférieur à 5, le chiffre précédent n’est pas modifié, si le dernier chiffre est supérieur ou égal à 5, le chiffre précédent est augmenté d’une unité. Procéder de proche en proche jusqu’à obtenir deux chiffres significatifs.

Noter comme résultat le nombre de Staphylocoques à coagulase positive par millilitre (produit liquide) ou par gramme (autre produit), exprimé en nombre compris entre 1,0 et 9,9 multiplié par 10x où x est la puissance appropriée de 10.

2) Estimation des petits nombres
Si la boîte, au niveau de l’échantillon pour essai ou de la suspension-mère, contient moins de 15 colonies, donner le résultat sous la forme :

- pour les produits liquides, nombre estimé de Staphylocoques à coagulase positive par millilitre :




où
C est le nombre de Staphylocoques à coagulase positive comptés sur les deux boîtes retenues

- pour les autres produits, nombre estimé de Staphylocoques à coagulase positive par gramme :




où
C est le nombre de Staphylocoques à coagulase positive comptés sur les deux boîtes retenues ;
d est le taux de dilution de la suspension-mère.

Si la boîte au niveau de l’échantillon pour essai ou de la suspension-mère ne contient aucune colonie de Staphylocoques à coagulase positive, donner le résultat sous la forme :
- moins de 1 Staphylocoque à coagulase positive par millilitre (produit liquide),
- moins de 1/d Staphylocoque à coagulase positive par gramme (autres produits) ; où d est le taux de dilution de la suspension-mère.

BARNES Gélose

Le milieu de Barnes est utilisé pour les isolement et dénombrement des Entérocoques dans l’eau et les produits alimentaires. Il favorise le développement des Streptocoques du groupe D et N, y compris Streptococcus bovis, mais également celui des Lactococcus, Leuconostoc et Pediococcus.

Il est à noter que la formulation de ce milieu comporte de l’acétate de thallium (inhibiteur de la flore secondaire), évitant par-là même, la stérilisation filtrante par addition de ce produit dans la base gélosée.

Ce milieu sélectif permet une différenciation des espèces fondée sur une réduction variable du triphényl tétrazolium (TTC) en formosan, ce qui se traduit par une coloration des colonies allant du blanc au rouge.



FORMULE (en g/l d’eau distillée)
.
Peptone 10.0
Extrait de levure 10.0
Glucose 10.0
Thallium acétate 0.1
Agar 14,0



Distribuer en flacons et stériliser 15 min à 118°C.

UTILISATION

Liquéfier le milieu et le maintenir aux environs de 50°C.
Dans 100 ml de gélose fondue, ajouter 1 ml de solution de chlorhydrate de triphényl tétrazolium (T.T.C.) à 1%, stérilisée par filtration.
Il est impératif de bien mélanger base gélosée et solution aqueuse stérile en évitant l’incorporation de bulles d’air.
Bien homogénéiser et couler en boîtes de Petri.
Faire sécher les boîtes et inoculer.
Incuber à 37°C pendant 24 h.

LECTURE

Les germes qui se développent, réduisent ou non le T.T.C. en produisant des teintes variées :
 -à centre rouge foncé et auréole blanche : Enterococcus faecalis, Lactococcus lactis ;
 -colonies très petites, à centre rouge foncé : Streptococcus bovis, equi ;
 -incolores ou roses pâles : Enterococcus faecium, durans ;
 -incolores à roses, convexes : Leuconostoc, Pediococcus ;
 -grises et plates : Lactobacillus.

Il faut préciser que ce milieu, encore préconisé par certains auteurs, n’est plus commercialisé. Les résultats obtenus n’ont pas toujours la sensibilité souhaitable.

B.C.P.
(Bouillon Lactosé au Pourpre de Bromocrésol)

Le Bouillon lactosé au pourpre de bromocrésol est un milieu utilisé en microbiologie alimentaire principalement au cours de l’analyse de l’eau. Il permet de rechercher et de dénombrer les coliformes, par la fermentation du lactose et la production de gaz.

La tryptone et l’extrait de viande apportent les éléments nutritifs azotés nécessaires à la croissance des bactéries.
La fermentation du lactose est mise en évidence par l’acidification du milieu qui provoque un virage au jaune de l’indicateur de pH (pourpre de bromocrésol), ainsi que par la production de gaz dans les cloches de Durham.



FORMULE (en g/l d’eau distillée)
.
Peptone 5,000
Extrait de viande 3,000
Lactose 10,000
Bromocrésol pourpre 0.025



Mélanger soigneusement jusqu’à complète dissolution.
Répartir en tubes, avec cloche de Durham, à raison de 10 ml par tube.
Stériliser à l’autoclave à 115°C pendant 15 min.


LECTURE

Ce milieu permet de mettre en évidence :

- La fermentation du lactose, qui se manifeste par une production d’acides entraînant le virage de l’indicateur au jaune.

- La production de gaz dans les cloches.

Tous les tubes présentant une fermentation du lactose avec gaz (susceptibles de contenir des coliformes) doivent être retenus pour les tests confirmatifs de l’analyse (isolement et identification des coliformes).

B.C.P.
(Gélose Lactosée au Pourpre de Bromocrésol)

La gélose lactosée au pourpre de bromocrésol est un milieu non inhibiteur sur lequel de nombreuses espèces de bactéries Gram-positives et Gram-négatives n’appartenant pas à la famille des Entérobactéries peuvent se développer. Ce milieu permet seulement de différencier les espèces qui fermentent le lactose de celles qui ne le fermentent pas.

Dans les produits polymicrobiens, ce milieu donne des résultats difficilement interprétables si la culture est très riche ou la lecture effectuée après 24 h. En effet ; le virage est rarement limité aux colonies : il diffuse dans le milieu. De plus, nous notons dans le cas d’une incubation prolongée une réalcalinisation rapide.

Certains laboratoires commercialisent sous l’appellation Gélose lactosée au B.C.P. des milieux contenant du cristal violet, et donc sélectif. En présence de Proteus, WINKLE (1947) recommande pour freiner la prolifération de ces derniers, l’addition de 0,28 g de jaune de métachrome par litre de milieu nutritif.

La fermentation du lactose entraîne la production d’acide révélée par le virage au jaune de l’indicateur coloré, le pourpre de bromocrésol. Les germes lactose-négatifs donnent des colonies bleues.





FORMULE (en g/l d’eau distillée)

Peptone 5,000
Extrait de viande 3,000
Lactose 10,000
Bromocrésol pourpre 0.025
Agar 12,000



Chauffer lentement en agitant fréquemment, puis porter à ébullition jusqu’à complète dissolution.
Répartir en flacons et stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 min.


UTILISATION

Juste avant emploi, sécher soigneusement les boîtes de milieu gélosé.
Si elles sont préparées à l’avance, les boîtes non séchées ne doivent pas être conservées plus de 4 h à la température du laboratoire ou plus d’un jour au réfrigérateur.

A partir d’un nombre déterminé de colonies caractéristiques prélevées sur chaque boîte retenue (cas du dénombrement des coliformes fécaux par comptage des colonies à 44,5°C) ou du contenu de chaque tube positif obtenu (cas du dénombrement des coliformes fécaux à 44,5°C avec calcul du nombre le plus probable), isoler par quadrants sur le milieu B.C.P. coulé en boîte de Petri.

Incuber à 37°C pendant 18 à 24 heures.
Cette durée d’incubation ne doit pas être dépassée sinon l’acidification du milieu peut entraîner des erreurs d’interprétation.

LECTURE

La fermentation du lactose se manifeste par une production d’acide qui entraîne le virage de l’indicateur au jaune. Les colonies bleues proviennent de germes lactose-négatifs.

1) cas général d’identification
- Colonies muqueuses :
• Klebsiella ;
•.Escherichia coli possédant l’antigène A.

- Colonies smooth ou rough laissant passer la lumière lorsqu’on les examine par transparence :
• Escherichia coli ;
• Citrobacter.

- Colonies, pas franchement jaunes et encore bleutées à la périphérie :
• Variétés lactose + lent des Escherichia.

B.C.P. + AMIDON
(Gélose Glucosée au Pourpre de Bromocrésol + Amidon)

La gélose glucosée au B.C.P. + amidon est préparée selon la norme expérimentale française NF V03-457 en vue du contrôle bactériologique des épices et aromates.

Elle est utilisée pour le dénombrement des germes aérobies ou des spores de Bacillus mésophiles ou thermophiles dans les sucres, épices, aromates et autres denrées alimentaires.


FORMULE (en g/l d’eau distillée)


Peptone 10,000
Glucose 5,000
Amidon soluble 2,000
Bromocrésol pourpre 0,040
Agar 15,000



Attendre 5 minutes, puis mélanger jusqu’à l’obtention d’une suspension homogène.
Faire chauffer lentement, en agitant fréquemment, puis porter à ébullition jusqu’à complète dissolution.
Répartir, puis stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 min.

UTILISATION ET LECTURE

1) Dénombrement des germes aérobies mésophiles dans le sucre.
Au moment de l’emploi, faire fondre le milieu au bain-marie bouillant, et le refroidir à 45-50°C environ. Inoculer 10 ml d’une solution de sucre à 20% par flacon de 100 ml. Homogénéiser parfaitement et répartir le mélange dans 5 boîtes de Petri stériles. Incuber à 30°C pendant 5 jours.

Dénombrer chaque jour séparément :
• les colonies jaunes (acidifiantes, glucose + );
• les colonies bleues (non acidifiantes, glucose -).

2) Dénombrement des spores de Bacillus mésophiles et thermophiles.
a) Dans les sucres : opérer sur 2 flacons, comme en « 1 », après avoir chauffé l’échantillon sucré 5 min à 100°C.

• Pour les spores de Bacillus mésophiles, incuber les boîtes à l’étuve à 30°C pendant 5 jours. Dénombrer chaque jour, séparément, les colonies acidifiantes et les colonies non acidifiantes.
• Pour les spores de Bacillus thermophiles, incuber les boîtes à l’étuve à 55°C pendant 3 jours après avoir pris soin de les obturer avec de l’huile de vaseline introduite dans le fond du couvercle. Dénombrer chaque jour séparément, les colonies acidifiantes et les colonies non acidifiantes.

b) Dans les épices et les aromates : au moment de l’emploi, faire fondre pour chaque échantillon, 4 flacons de milieu au bain-marie bouillant. Ne pas les refroidir.
• Préparer une suspension mère au 1/10 de l’échantillon à analyser :
- dans 2 flacons, introduire 10 ml de cette suspension ;
- dans les 2 autres flacons, introduire 1 ml de la suspension.
Homogénéiser parfaitement.

• Placer tout de suite les flacons de milieu inoculé dans un bain-marie bouillant et les maintenir 30 minutes. Mélanger au moins 3 fois pendant le chauffage.

• Dès la fin du chauffage, répartir tout le contenu de chaque flacon respectivement dans 4 séries de boîtes de Petri stériles (2 séries correspondant à 10 ml de suspension mère, 2 séries correspondant à 1 ml de suspension mère). Laisser refroidir sur une surface froide et horizontale et retourner les boîtes fermées.

• Prendre 1 série de 5 boîtes à 10 ml de suspension mère et
1 série de 5 boîtes à 1 ml de suspension mère.

• Dans chaque couvercle, verser quelques gouttes d’huile de vaseline stérile (ou bien, fermer les boîtes avec une bande de film plastique).

• Mettre ces deux séries à incuber à 55°C pendant 5 jours, ceci afin de dénombrer les spores de Bacillus thermophiles. Mettre les deux autres séries à 30°C pendant 5 jours, ceci afin de dénombrer les spores de Bacillus mésophiles.

• Examiner les boîtes tous les jours et dénombrer séparément pour les [i]Bacillus mésophiles et thermophiles, les colonies acidifiantes et non acidifiantes.

La gélose bile-esculine sert à l’identification préliminaire des Streptocoques fécaux (Groupe D de LANCEFIELD) conformément à la formulation indiquée par SWAN et FACKLAM et MOODY.

Alors que la prolifération des Streptocoques tolérant la bile n’est pas ralentie, la croissance des bactéries secondaires Gram-positives est largement inhibée par les sels biliaires.
Les Streptocoques du Groupe D hydrolysent le glucoside esculine en glucose et esculétine. Cette dernière forme avec des ions fer (III) un complexe vert olive à noir. La croissance des Entérocoques peut être améliorée en ajoutant du sérum de cheval au milieu.

Ce milieu est également préconisé pour les essais présomptifs de pathogénicité dans la norme NF ISO 10273 (V 08-027) relative aux directives générales pour la recherche des Yersinia enterolitica présumées pathogènes.




FORMULE (en g/l d’eau distillée)
.
Extrait de viande 3,0
Peptone 5,0
Esculine 1,0
Sels biliaires 40,0
Fer citrate (III) 0,5
Agar 8 à 18



Dissoudre les composants dans l’eau en portant à ébullition. Ne pas surchauffer.
Répartir le milieu par quantité de 10 ml dans des tubes à essai ou en boîtes de Petri à raison d’environ 15 ml par boîte.
Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes.

UTILISATION

Etaler le matériel à examiner à la surface des boîtes et incuber à 37°C pendant 3 jours.

Dans le cas des essais présomptifs de la pathogénicité de Yersinia enterolitica, retenir les colonies sélectionnées à partir des milieux sélectifs puis repiquées sur gélose nutritive, répondant aux critères suivants :
- Recherche de la lysine carboxylase : négatif
- Recherche de l’ornithine carboxylase : positif
- Fermentation du rhamnose : négatif
- Fermentation du saccharose : positif
- Hydrolyse du citrate : négatif.

A l’aide d’une anse bouclée, ensemencer le milieu pour la recherche de l’esculine avec chacune des colonies isolées sur gélose nutritive et sélectionnées.

Ensemencer en strie la pente de la gélose.
Incuber à 30°C pendant 24 heures.

NB : de rares souches de Yersinia enterolitica présumées pathogènes, saccharose négatif ont été isolées chez le porc.
Les Yersinia enterolitica biovar 5 ont été trouvées négatives pour l’ornithine décarboxylase.

LECTURE

- Pour les Entérocoques, dans le cas de leur présence, le milieu nutritif prend en général une coloration foncée autour des colonies ayant déjà poussé au cours des 24 premières heures. Lorsque les colonies d’Entérocoques sont nombreuses et très voisines, nous observons une coloration de toute la boîte.

Lorsqu’une coloration foncée ne se manifeste pas au bout de trois jours d’incubation, nous pouvons être sûrs de l’absence de Streptocoques du groupe D.

- Dans le cas de la présomption de pathogénicité de Yersinia enterolitica, une coloration noire autour de la culture indique une réaction positive.

Il est nécessaire d’accompagner cette recherche par celles sur la fermentation de la salicine, la pyrazinamidase et de l’exigence en calcium à 37°C.

NB : Le biotype 1a (Américain) est esculine +
Le biotype 1e (Européen) est esculine -.






Le bouillon lactosé bilié au vert brillant est utilisé pour la numération des germes par la détermination du titre ou selon la technique du nombre le plus probable (N.P.P.), d’Escherichia coli et d’autres coliformes fécaux dans les eaux résiduaires, le lait, les produits laitiers et d’autres produits alimentaires. Il constitue le milieu de confirmation dans les directives générales pour le dénombrement des coliformes par la technique du nombre le plus probable (N.P.P.) norme NF ISO 4831 (V 08-016). Il est également préconisé dans le dénombrement des coliformes dans les laits de conserve (NF V 04-015), dans le dénombrement des coliformes fécaux dans les eaux conchylicoles et dans les coquillages marins vivants (NF V 45-110). Il est conforme aux normes DIN 10172.

Il est préparé conformément aux recommandations des Standards Methods (Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, Standard Methods for the Examination of Dairy Products, et dans Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods).

La recherche et la mise au point d’un milieu de culture inhibant les microorganismes autres que les coliformes ont depuis longtemps intéressé les microbiologistes. Dès 1926, DUNHAM et SCHOENLEIN ont étudié les proportions de bile et de vert brillant susceptibles de donner de bons résultats. Dans ses travaux, JORDAN a montré la supériorité de ce milieu comparativement au bouillon lactosé pour la détection des coliformes dans l’eau.
Pour le contrôle de la pasteurisation du lait, MacCRADY et LANGEVIN ont utilisé avec satisfaction le bouillon lactosé à la bile et au vert brillant pour la détection des coliformes. MacKENZIE a vérifié que la teneur en vert brillant est suffisante pour inhiber effectivement la culture d’anaérobies fermentant le lactose et en particulier Clostridium perfringens.

La fermentation du lactose avec dégagement gazeux, témoin de la présence d’Escherichia coli et d’autres coliformes fécaux, est mise en évidence au moyen de cloches de Durham. D’autres coliformes peuvent s’y développer, mais généralement sans gaz.
Le milieu peut être additionné de M.U.G (4-méthyl-umbelliféryl-ß-D-glucuronide) afin de détecter Escherichia coli.




FORMULE (en g/l d’eau distillée)

a) milieu simple concentration

Tryptose 10,0000
Lactose 10,0000
Bile de bœuf déshydratée 20,0000
Vert brillant 0,0133



b) milieu triple concentration ( NF V 45-110)

Peptone 30,0000
Lactose 30,0000
Bile de bœuf déshydratée 60,0000
Vert brillant 0,0399


Répartir en tubes contenant une cloche de Durham à raison de 10 ml par tube.
Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes.
Les cloches de Durham ne doivent pas contenir d’air après stérilisation.


UTILISATION ET LECTURE

[u)(b]a) laits de conserve (NF V 04-015)[/u][/b]
Prendre trois tubes de milieu sélectif simple concentration. Transférer dans chacun d’eux, avec une pipette stérile de 1 ml, 1 ml de la suspension mère ( au 1/10 pour les laits en poudre, au 1/3 pour les laits concentrés sucrés).
Placer les tubes à l’étuve à 30°C pendant 48 ±2 heures.

A partir de chaque tube incubé, transférer successivement la valeur de trois anses bouclées dans un tube de milieu sélectif.
Faire incuber à 30°C pendant 24 ± 2 heures, ou si à ce stade on n’observe pas de dégagement gazeux pendant 48 ± 2 heures.

Compter le nombre de tubes positifs où l’on note un dégagement de gaz.
Le résultat est exprimé par le nombre le plus probable (NPP) de coliformes contenu dans 1 g de produit, accompagné éventuellement des valeurs les plus faibles et les plus élevées correspondant aux limites de confiance.

Le résultat est exprimé par le nombre le plus probable (NPP) de coliformes contenu dans 1 g de produit, accompagné éventuellement des valeurs les plus faibles et les plus élevées correspondant aux limites de confiance.

b) eaux conchylicoles et coquillages marins vivants (NF V 45-110)
Prendre trois tubes de milieu BLBVB à triple concentration. Transférer dans chacun des tubes 10 ml de l’échantillon pour essai.
Prendre ensuite trois autres tubes de milieu triple concentration et transférer dans chacun des tubes 10 ml de la dilution suivante.
Opérer de même avec les dilutions suivantes.

NB : à chaque fois qu’une plus grande précision sera demandée, il est nécessaire d’ensemencer des séries de cinq tubes en utilisant le même mode opératoire.

Faire incuber à l’étuve à 37°C pendant 48 h ± 2 h.

Noter, à l’issue de l’incubation, le nombre de tubes lactose positif, c’est à dire présentant un dégagement gazeux très net (1/10 du volume total de la cloche)
A partir de chaque tube, ensemencer avec une anse bouclée, un tube de milieu simple concentration et un tube d’eau peptonée.

Faire incuber les tubes pendant 24 heures dans un bain-marie réglé à 44°C ± 0,2°C .

Examiner les tubes et compter comme positif les tubes présentant un dégagement gazeux net.
Rechercher la production d’indole dans le tube d’eau peptonée

On admet qu’il y a présence de coliformes fécaux lorsqu’il y a simultanément production de gaz et présence d’indole.

Pour chaque échantillon, exprimer le résultat par le nombre le plus probable (NPP) de coliformes fécaux contenus dans 100 ml d’eau conchylicoles ou de chair de coquillage.
- si tous les tubes sont négatifs, le nombre NPP minimal sera précédé du signe : <
- si tous les tubes sont positifs, le nombre NPP maximal sera précédé du signe : >

Noter le nombre de tubes positifs afin d’obtenir un nombre caractéristique à trois chiffres, dont
- le chiffre des centaines correspond au nombre de tubes positifs de la dilution la plus faible,
- celui des dizaines à la dilution intermédiaire,
- celui des unités à la dilution la plus grande.

Se reporter à la table pour la détermination de l’indice NPP

c) techniques classiques
A partir de chaque tube de milieu d’enrichissement sélectif (Bouillon à la tryptose et au lauryl sulfate) incubé au préalable à 30°C, 35°C ou 37°C (selon accord), ensemencer avec une anse bouclée (öse) un tube de BLBVB simple concentration.
Incuber à 30°C, 35°C ou 37°C (selon accord) pendant 24 h  2 h ou si, à ce stade on n’observe pas de dégagement de gaz, pendant 48 h  2 h.


L’apparition de gaz dans les cloches (volume au moins égal au 1/10 du volume total de la cloche) accompagné d’un trouble, traduit la fermentation du lactose.

Pour chaque dilution, compter le nombre total de tubes où l’on note un dégagement gazeux (tubes positifs) après 24 h et, éventuellement après 48 h. Pour chaque échantillon examiné ; retenir trois dilutions successives en se conformant à l’une des règles suivantes :

- au moins une dilution révèle trois tubes positifs
Choisir la dilution la plus élevée (c’est à dire celle ayant la plus faible concentration en échantillon) révélant trois tubes positifs, ainsi que les deux dilutions plus élevées suivant immédiatement
.
S’il a été préparé un nombre insuffisant de dilutions au-delà de la dilution la plus élevée révélant trois tubes positifs ; choisir à la place les trois dilutions les plus élevées de la série (c’est-à-dire celles ayant la plus faible concentration en échantillon)


- pas de dilution révélant trois tubes positifs
Le cas précédent ne peut être appliqué. Choisir les trois dilutions les plus élevées de la série (c’est à dire celles ayant la plus faible concentration en échantillon) qui contiennent au moins une réponse positive.

Il est bien connu que des variations importantes peuvent être observées avec la technique du N.P.P.. De ce fait, les résultats obtenus selon cette méthode doivent être utilisés avec prudence.

Le nombre de coliformes par millilitre ou par gramme est obtenu en multipliant le coefficient NPP par l’inverse du taux de dilution la moins élevée ( c’est à dire celle ayant la plus grande teneur en échantillon).
Dans le cas où la dilution retenue la moins élevée correspond aux tubes de double concentration, diviser préalablement le coefficient NPP par 10.

Exprimer le résultat par un chiffre compris entre 1,0 et 9,9 multiplié par 10x ou x est la puissance appropriée de 10.

Ce milieu est préconisé comme milieu de base pour les cas généraux dans la recherche des Bacillus thermophiles et des Clostridium thermophiles dans les conserves.

Les Bacillus thermophiles sont des micro-organismes sporulés, Gram positif en culture jeune, se développant en aérobiose à 55°C, catalase positive (bien que certaines souches donnent une catalase faible ou tardive), lorsque l’essai est exécuté selon la norme.
Il fait l’objet d’une recommandation dans la norme AFNOR NF V 08-404.

Les Clostridium thermophiles sont des microorganismes sporulés se développant uniquement en anaérobiose à la température de 55°C, lorsque l’essai est réalisé selon la norme.
Il fait l’objet d’une recommandation dans la norme AFNOR NF V 08-405.

Il existe un autre type de bouillon glucosé pour la culture et la multiplication d’un grand nombre de microorganismes et qui sert surtout à la mise en évidence de croissances typiques (formation de dépôts ou de chaînes) et à la réalisation de la différenciation des groupes sérologiques de Streptocoques. Ce milieu ne contient que de la peptone de caséine, du chlorure de sodium et aucun autre glucide fermentescible que le glucose et il convient donc à la mise en évidence de l’utilisation du glucose par addition préalable d’un indicateur de pH.

FORMULE (en g/l d’eau distillée)
.
Tryptone 4
Tryptose 4
Sojatone 3
Extrait de levure 4
Sodium chlorure 5
Glucose 5
Amidon soluble 1
Agar 1



Dissoudre les composants et ajuster le pH.
Dans le cas de l’étude de produits à pH<4,5, le pH peut être ajusté, après stérilisation, avec de l’acide lactique ou citrique.
Répartir le milieu de culture par quantités de 10 ml dans des tubes.
Stériliser à 121°C pendant 15 min.


UTILISATION

A) RECHERCHE DES BACILLUS THERMOPHILES (NF V 08-404)

a) Recherche des formes asporulées
Ensemencer à raison de 3 tubes par milieu de culture. Le rapport inoculum/volume du milieu doit être de 1/10.
Pour les produits hétérogènes, la composition de l’inoculum doit être représentative de la conserve examinée.

b) Recherche des formes sporulées
- cas des conserves de pH> 4,5
Procéder comme précédemment puis plonger pendant 10 minutes, les tubes de milieu de culture ensemencés, dans un bain d’eau bouillante.
Il convient de veiller à ce que le niveau du bain soit supérieur au niveau du milieu de culture dans les tubes.
Retirer ensuite les tubes et les refroidir immédiatement dans un courant d’eau froide.

Cette technique a été choisie en raison de sa commodité et de son efficacité : toute croissance bactérienne ultérieure est due à la présence de spores thermorésistantes dans l’inoculum.

- cas des conserves de pH<4,5
Procéder à un chauffage, dans les mêmes conditions que ci-dessus mais à une température de 80°C maintenue pendant 10 minutes.

c) Incubation des milieux de culture
Placer les tubes de milieux de culture dans une étuve à 55°C pendant 5 jours.


LECTURE

Observer chaque jour les tubes, afin de déceler l’apparition de développement bactérien.
Repérer et sortir de l’étuve les tubes présentant un trouble et dès l’observation de ce dernier, réaliser un examen microscopique, après coloration de Gram, afin de mettre en évidence des bacilles à Gram positif en culture jeune et la présence éventuelle de spores.

- LECTURE PRELIMINAIRE

• CAS 1 : Aucun développement de bacilles à Gram positif n’est mis en évidence dans les milieux de culture ensemencés : pas d’essai de confirmation à effectuer.
Absence de Bacillus thermophile

• CAS 2 : Aucun développement de bacilles à Gram positif n’est mis en évidence dans les tubes ensemencés pour la recherche des formes végétatives, mais un développement à Gram positif est mis en évidence dans les tubes ensemencés pour la recherche des formes sporulées : effectuer à partir de ces derniers les tests de confirmation ( essai de culture en aérobiose et recherche de la catalase).

• CAS 3 : Un développement de bacilles à Gram positif est mis en évidence dans les tubes ensemencés pour la recherche des formes végétatives, mais aucun développement à Gram positif n’est mis en évidence dans les tubes ensemencés pour la recherche des formes sporulées : effectuer à partir des tubes positifs tous les essais de confirmation ( mise en évidence des spores, essai de culture en aérobiose et recherche de la catalase).

• CAS 4 : Un développement de bacilles à Gram positif est mis en évidence dans les tubes ensemencés ( recherches des formes végétatives et des formes sporulées) : effectuer à partir des tubes positifs sur la recherche des formes végétatives tous les essais de confirmation, et à partir des tubes positifs sur la recherche des formes sporulées les essais de confirmation ( essai de culture en aérobiose et recherche de la catalase).


- CONFIRMATION

• Mise en évidence des spores
A partir de chaque tube de milieu de culture ensemencé pour la recherche des formes végétatives présentant un développement microbien, ensemencer un tube du même milieu.
Pour les conserves de pH4,5, plonger pendant 10 minutes les tubes ensemencés dans un bain d’eau à ébullition.
Pour les conserves à pH<4,5, plonger pendant 10 minutes les tubes ensemencés dans un bain d’eau à 80°C.
Incuber à 55°C pendant 5 jours puis procéder à la lecture comme décrit précédemment.
L’apparition d’une culture traduit l’aptitude à la sporulation des formes bacillaires observées dans les milieux de culture ensemencés pour la recherche des formes végétatives.


• Essai de culture en aérobiose et recherche de la catalase
a) A partir des milieux de culture ensemencés (formes végétatives et/ou sporulées) présentant un développement microbien, ensemencer en stries deux boîtes de Petri de milieu de culture gélosé ( de préférence milieu au jus de tomate) l’une après l’autre en se servant de la même anse.

Incuber à 55°C pendant 18 à 24 heures.
Observer la présence ou l’absence de colonies. Les souches de Bacillus thermophiles ont parfois des difficultés de croissance, ce qui peut rendre l’observation des colonies difficile.

b) Lorsqu’il y a présence de colonies, les repérer selon leur type morphologique, émulsionner une colonie isolée, pour chaque type, dans un tube à hémolyse contenant 1 ml d’eau stérile ; y ajouter 2 à 3 gouttes du réactif pour la recherche de la catalase. La formation de bulle de gaz indique la présence d’une catalase.

• Résultats des essais de confirmation

CAS 1:
- Une culture en aérobiose est obtenue, la recherche de la catalase est positive, conclure :
Présence de Bacillus thermophiles.

- Une culture en aérobiose est obtenue, la recherche de la catalase est négative, conclure :
Présence de Bacillus thermophiles à catalase négative.

- Aucune culture n’est obtenue en aérobiose, conclure :
Absence de Bacillus thermophile.


CAS 2:
- Un développement de bacilles à Gram Positif est mis en évidence, une culture en aérobiose est obtenue, la recherche de la catalase est positive, conclure :
Présence de Bacillus thermophiles.

- Un développement de bacilles à Gram positif est mis en évidence, une culture en aérobiose est obtenue, la recherche de la catalase est négative, conclure :
Présence de Bacillus thermophiles à catalase négative.

- Un développement de bacilles à Gram positif est mis en évidence, mais aucune culture en aérobiose n’est obtenue, conclure :
Absence de Bacillus thermophile.

- Aucun développement de bacilles à Gram positif n’est mis en évidence et aucune culture n’est obtenue en aérobiose, conclure :
Absence de Bacillus thermophile.

- Aucun développement de bacilles à Gram positif n’est mis en évidence, mais une culture en aérobiose est obtenue et la recherche de la catalase est négative ou positive, conclure :
Présence de Bacillus thermophiles dont l’aptitude à la sporulation n’a pas été démontrée.

CAS 3
- A partir des tubes de recherche des formes sporulées, une culture en aérobiose est obtenue, la recherche de la catalase est positive, conclure :
Présence de Bacillus thermophiles.

- A partir des tubes de recherche des formes sporulées, une culture en aérobiose est obtenue, la recherche de la catalase est négative. Utiliser alors les résultats obtenus à partir des essais effectués avec les tubes positifs de la recherche des formes végétatives lorsque la recherche de la culture en aérobiose est positive et si le test de la catalase est positif, conclure :
Présence de Bacillus thermophiles.
Si le test de la catalase est négatif, conclure :
Présence de Bacillus thermophiles catalase négative.

- A partir des tubes positifs (recherche des formes sporulées), aucune culture n’est obtenue en aérobiose. Utiliser alors les résultats des essais effectués à partir des tubes pour la recherche des formes végétatives. Lire et interpréter les résultats comme ci-dessus (cas 3).

C) RECHERCHE DES CLOSTRIDIUM THERMOPHILES (NF V 08-405)

• Recherche des formes végétatives

On utilise généralement 1 g ou 1 ml de produit pour 10 ml de milieu.
Ensemencer à raison de trois tubes par milieu de culture préalablement désaéré, puis recouvrir chaque tube avec de l’huile de vaseline pure stérile, de la paraffine stérile ou de la gélose blanche préalablement fondues

• Recherche des formes sporulées

Ensemencer comme précédemment puis plonger pendant 10 minutes les tubes dans un bain d’eau bouillante.
Il convient de veiller à ce que le niveau de l’eau du bain soit supérieur au niveau du milieu de culture dans les tubes.
Retirer ensuite les tubes et les refroidir sous courant d’eau froide.
Cette technique a été choisie en raison de sa facilité et de son efficacité : toute croissance bactérienne est due à la présence de spores thermorésistantes dans l’inoculum.

- Incubation des milieux de culture
Placer les tubes de milieu de culture ensemencés à l’étuve à 55°C.

- Lecture
Observer chaque jour les tubes, afin de déceler l’apparition de culture. En l’absence de culture, prolonger l’incubation pendant 8 jours.
Sortir les tubes de l’étuve dès l’apparition d’un signe de culture : trouble du milieu, dégagement gazeux.

- Résultats des ensemencements
CAS 1 : aucun développement de bacilles n’est mis en évidence dans les milieux de culture ensemencés : pas d’essai de confirmation à effectuer.
Absence de Clostridium thermophile.

CAS 2 : aucun développement dans la recherche des formes végétatives, mais un développement est mis en évidence dans la recherche des formes sporulées : effectuer les essais de confirmation sur la mise en évidence du caractère anaérobie.

CAS 3 : un développement est mis en évidence dans la recherche des formes végétatives, mais aucun développement dans la recherche des formes sporulées : effectuer les essais de confirmation sur la mise en évidence de l’aptitude à la sporulation ainsi que ceux sur la mise en évidence du caractère anaérobie.

CAS 4 : un développement est mis en évidence dans les deux recherches (formes végétatives et sporulées) : effectuer à partir de la recherche des formes végétatives tous les essais de confirmation et à partir de la recherche sur les formes sporulées, les essais de confirmation sur la mise en évidence du caractère anaérobie.

- Essais de confirmation

• mise en évidence de l’aptitude à la sporulation
A partir de chaque tube ensemencé pour la recherche des formes végétatives présentant un développement microbien, ensemencer un tube de Bouillon glucosé et procéder comme pour la recherche des formes sporulées.
Incuber à 55°C pendant 24 heures à 8 jours si nécessaire.
Procéder à la lecture. L’apparition d’une culture traduit l’aptitude à la sporulation des formes bacillaires observées dans les milieux de culture pour la recherche des formes végétatives.

• Mise en évidence du caractère anaérobie
Ensemencer en stries, avec une öse, à partir de chaque tube de milieu liquide, la surface d’une gélose Columbia.
(voir Utilisation et lecture à gélose Columbia)

- Résultats et interprétation

• CAS 1 :
- Pour au moins un type morphologique isolé, une culture en anaérobiose est obtenue, sans culture en aérobiose, conclure :
Présence de Clostridium thermophiles.
Pour tous les types morphologiques isolés, une culture en aérobiose est obtenue, conclure :
Absence de Clostridium thermophile.

• CAS 2
- Un développement de bacilles est mis en évidence lors de l’essai de la sporulation, et pour au moins un type morphologique isolé, une culture en anaérobiose est observée et aucune culture n’est obtenue en aérobiose, conclure :
Présence de Clostridium thermophiles .
Remarque : il convient de s’assurer, dans ce cas, qu’il s’agit de la même souche.
Dans le cas contraire, conclure
« Présence de Clostridium thermophiles, dont l’aptitude à la sporulation n’a pu être démontrée dans les conditions de l’essai »

- Un développement de bacilles est mis en évidence lors de l’essai de la sporulation, et pour tous les types morphologiques isolés, une culture en aérobiose est obtenue, conclure :
Absence de Clostridium thermophile.

- Aucun développement de bacilles n’est mis en évidence lors de l’essai de sporulation, mais pour tous les types morphologiques isolés, une culture en aérobiose est obtenue, conclure :
Absence de Clostridium thermophile.

- Aucun développement de bacilles n’est mis en évidence lors de l’essai de la sporulation et pour au moins un type morphologique isolé, une culture en anaérobiose est observée et aucune culture n’est obtenue en aérobiose, conclure :
Présence de Clostridium thermophiles dont l’aptitude à la sporulation n’a pu être démontrée dans les conditions de l’essai.


• CAS 3
- A partir des tubes positifs pour la recherche des formes sporulées, et pour au moins un type morphologique isolé, une culture en anaérobiose est observée et aucune culture n’est obtenue en aérobiose, conclure :
Présence de Clostridium thermophiles.

- A partir de tubes positifs pour la recherche des formes sporulées, pour tous les types morphologiques isolés, une culture en anaérobiose est obtenue. Utiliser alors les résultats des essais effectués à partir des tubes pour la recherche des formes végétatives. Lire et interpréter comme dans le cas 2.

Le bouillon nutritif est un milieu liquide qui permet la croissance des germes ne présentant pas d’exigences particulières et dont il maintient l’aspect morphologique classique macroscopique et microscopique.

Il est très souvent recommandé dans les repiquages pour amplifier le matériel lors de la recherche des Salmonella et le dénombrement des coliformes dans de nombreux modes opératoires préconisés par la norme AFNOR.

Il peut servir de milieu de stockage et comme base pour la préparation des milieux spéciaux.

Le bouillon nutritif avec une addition de 0,05% de tellurite de potassium est un excellent milieu d’enrichissement pour Listeria monocytogenes.


FORMULE (en g/l d’eau distillée)
.
Peptone 5
Extrait de viande 5
Extrait de levure 2
Sodium chlorure 5



Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes.







Ce milieu est utilisé pour les cultures en surface des Clostridium et autres organismes anaérobies. Il contient des agents réducteurs (thioglycollate, formaldehydesulfoxylate, cystine) qui apportent des conditions adéquates d'anaérobiose. Le bleu de méthylène sert d’indicateur redox , sa décoloration indique l’anaérobiose.

FORMULE (en g/l d’eau distillée)
.
Peptone de caséine 10,000
Peptone de soja 5,000
Extrait de levure 5,000
L-cystine 0,400
Glucose 10,000
Sodium chlorure 5,000
Sodium thioglycollate 2,000
Sodium formaldehydesulfoxylate 1,000
Bleu de méthylène 0,002
Agar 12,600



Autoclaver 15 minutes à 121°C puis couler en boîtes de Petri.


UTILISATION ET LECTURE

Pour l’identification des bactéries anaérobies sporulées inoculer l’échantillon après un passage à une température de 80-100°C.
Etaler l’échantillon sur les boîtes et incuber 48 heures à 35°C en conditions anaérobies (ex : anaérocult)






C’est un milieu nutritif pour l’enrichissement, l’isolement et la culture des espèces de Brucella, et principalement des espèces pathogènes Brucella abortus et Brucella suis[/] à partir du matériel biologique, du lait, des produits laitiers et d’autres produits d’origine animale.

Il est formulé en accord avec l’American Public Health Association.
Le milieu de base est supplémenté avec de l’hydrogénosulfite de sodium, pour la mise en évidence de [i]Campylobacter dans la norme AFNOR V 08-026 (NF ISO 10272) relative à la méthode horizontale pour la recherche de Campylobacter thermotolérants. Il est recommandé comme milieu de confirmation pour l’examen de la morphologie, de la mobilité et de la croissance à 25°C.

La forte nutrivité du milieu est due à sa richesse en peptones, extrait de levure et glucose. L’extrait de levure est une source du complexe vitaminique B. et le glucose intervient comme source d’énergie , le chlorure de sodium maintient l’équilibre osmotique et l’hydrogénosulfite de sodium agit comme substance réductrice.

COMPOSITION (en g/l d'eau distillée)

Tryptone 10,0
Peptone pepsique de viande 10,0
Glucose 1,0
Extrait de levure 2,0
Sodium chlorure 5,0
Sodium hydrogénosulfite 0,1



Dissoudre les composants de base en chauffant si nécessaire.
Répartir le milieu en tubes à raison de 10 ml/tube.
Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes.


UTILISATION ET LECTURE
.
a) Sélection des colonies à partir du milieu sélectif
A partir du milieu d’isolement sélectif imposé (gélose KARMALI ) et du deuxième milieu sélectif au choix (BUTZLER, SKIRROW, PRESTON……) , sélectionner cinq colonies typiques et /ou suspectes, sur l’ensemble des boîtes ensemencées. S’il y en a moins de cinq, retenir toutes les colonies.

Comme les germes ne survivent qu’en atmosphère microaérophile, appliquer les tests ultérieurs sans délai.

b) Examen de la morphologie et de la mobilité
Mettre en suspension séparément chacune des colonies sélectionnées dans 1 ml de bouillon Brucella.

A partir d’une colonie bien isolée, réaliser une coloration de Gram sur chacune des boîtes.

Examiner au microscope la morphologie et la mobilité de chacune des colonies retenues.

Retenir pour les observations ultérieures, toutes les suspensions dans lesquelles on observe des bacilles incurvés Gram – dont le mouvement en déplacement en vrille est caractéristique.


c) Examen complémentaire et étude de la croissance à 25°C
Ensemencer à l’öse la surface d’une gélose Columbia au sang avec chaque suspension retenue afin de permettre le développement de colonies bien isolées.
Incuber les boîtes ensemencées à 42°C en atmosphère microaérophile pendant 24 heures.

A partir des colonies isolées ensemencer un tube de bouillon Brucella.
Incuber à 25°C en atmosphère microaérophile pendant 2 à 5 jours

Examiner s’il y a ou non-croissance.

d) recherche de la sensibilité à l’acide nalidixique et à la céphalotine
Ensemencer, à l’aide d’une anse bouclée, les colonies isolées sur les milieux d’isolement sélectif de manière à obtenir une suspension de densité 0,5 sur l’échelle de Mac Farland dans le bouillon Brucella.

Diluer ensuite cette suspension au 1/10 dans le même bouillon.
Inonder la surface d’une gélose de Mueller Hinton à 5% de sang avec la suspension. Laisser en contact 5 minutes puis rejeter l’excès de suspension.

Sécher les boîtes à l’étuve à 37°C pendant 10 minutes.
Placer à la surface de la gélose un disque d’acide nalidixique (30µg) et un disque de céphalotine (30µg).
Incuber à 37°C en atmosphère microaérophile pendant 24 heures.


Interpréter la croissance bactérienne de la façon suivante :
- une croissance au contact du disque est classée comme résistante,
- une présence d’une zone d’inhibition de la croissance (quelle que soit l’importance de la zone d’inhibition) est classée comme sensible.

e) autres examens complémentaires :
Les essais biochimiques complémentaires sont : la recherche de l’oxydase, la fermentation du glucose, l’utilisation du lactose et/ou du saccharose, la recherche de la catalase et la recherche de l’hydrolyse de l’hippurate

Les Campylobacter thermotolérants sont de petits bacilles incurvés, à mobilité avec des déplacements en vrille caractéristiques, Gram -, oxydase +, glucose, lactose et saccharose négatifs.

Parmi les Campylobacter spp présentant une croissance à 42°C, certaines espèces constituent le groupe des thermotolérants dont les plus fréquemment rencontrés sont les Campylobacter jejuni et les Campylobacter coli. Cependant d’autres espèces ont été décrites ; les caractéristiques données dans le tableau ci-dessous permettent de les différencier.

Selon l’interprétation des résultats, indiquer la présence ou l’absence de Campylobacter thermotolérants dans une prise d’essai de x g ou x ml de produit.







Campylobacter fetus est connu comme l’agent pathogène des avortements enzootiques et des entérites chez les animaux domestiques. Chez l’homme, les entérites sont surtout dues aux Campylobacter jejuni et Campylobacter coli. Les voies de transmission les plus fréquentes vers l’homme sont les aliments provenant d’animaux atteints, l’eau ainsi que le contact direct avec ces animaux.

Un milieu de culture riche en substances nutritives et incubé en atmosphère gazeuse réduite en oxygène (5 à 10%) et enrichie en dioxyde de carbone permet une bonne croissance des Campylobacter. Les antibiotiques ajoutés sous forme de supplément sélectif des Campylobacter inhibent une grande partie de la flore secondaire. Le supplément sélectif est un mélange de quatre antibiotiques différents.

Il est recommandé comme milieu sélectif dans la norme V 08-026 (ISO 10272) concernant la méthode horizontale pour la recherche de Campylobacter thermotolérants.


FORMULE

Milieu de base (Gélose Columbia) 940 ml
Sang de mouton défibriné stérile 50 ml
Solution d’antibiotique 10 ml

1) Milieu de base
Voir la composition du milieu à gélose Columbia.

2) Solution d’antibiotiques

Céfopérazone 0.03g
Rifampicine 0.02g
Colistine 20000U
Amphotéricine B 0.04g
Mélange eau/éthanol 50/50 (V/V) 20ml

Dissoudre les composants dans le mélange eau/éthanol.
Stériliser par filtration.

3) MILIEU COMPLET

Ajouter aseptiquement au milieu de base préalablement fondu et refroidi à environ 47°C, le sang puis la solution d’antibiotiques et bien mélanger.

Verser environ 15 ml du milieu complet dans des boîtes de Petri stériles. Laisser se solidifier.

Juste avant l’emploi, sécher soigneusement les boîtes de milieu gélosé, de préférence après avoir retiré les couvercles et retourné les boîtes dans une enceinte de séchage pendant 30 minutes ou jusqu’à ce que la surface de la gélose soit exempte d’humidité visible.

Si elles ont été préparées à l’avance, les boîtes de milieu gélosé non séchées ne doivent pas être conservées plus de 4 heures à la température ambiante ou plus de 3 jours à +4°C.

UTILISATION ET LECTURE

a) Isolement direct
Pour les produits suspectés contenir une quantité importante de Campylobacter thermotolérants, procéder à un isolement en ensemençant à l’aide d’une anse bouclée, la suspension mère non incubée sur la surface de la gélose KARMALI (milieu sélectif obligatoire préconisé par la norme) et éventuellement sur un autre milieu sélectif pouvant être la gélose BUTZLER.

Incuber à 42°C en atmosphère microaérophile (oxygène 5%, dioxyde de carbone 10%, azote 85%).
Examiner après 48 h, 72 h et, éventuellement 5 jours, pour contrôler s’il y a présence de colonies présumées être des Campylobacter thermotolérants.
Procéder alors à la confirmation.

b) Isolement après enrichissement
Ensemencer, à l’aide d’une anse bouclée, la surface d’une gélose KARMALI ainsi que la surface d’une gélose BUTZLER avec la culture obtenue dans le milieu d’enrichissement (Bouillon de PRESTON ou bouillon de PARK et SANDERS).
Incuber les boîtes à 42°C en atmosphère microaérophile.

Après 24 h, ou plus généralement, 48 h et même 3 jours à 5 jours d’incubation, examiner les boîtes afin de rechercher la présence de colonies caractéristiques de Campylobacter thermotolérants.

Sur la gélose BUTZLER, les colonies caractéristiques apparaissent grises à brunes.



Procéder ensuite à la confirmation en sélectionnant cinq colonies typiques et /ou suspectes sur l’ensemble des boîtes ensemencées et s’il y en a moins de cinq, retenir toutes les colonies.

Comme les germes ne survivent qu’en atmosphère micro-aérophile, appliquer les tests ultérieurs sans délai.

A partir des colonies isolées, réaliser une coloration de Gram et mettre en œuvre les études morphologiques (mobilité), physiologiques (croissance à 25°C) et biochimiques (fermentation du glucose, utilisation du lactose et/ou du saccharose ; production d’hydrogène sulfuré, recherche de la catalase,. de la sensibilité à l’acide nalidixique et à la céphalotine, de l’hydrolyse de l’hippurate).

Les Campylobacter thermotolérants sont de petits bacilles incurvés, à mobilité avec des déplacements en vrille caractéristiques, Gram -, oxydase +, glucose, lactose et saccharose négatifs.

Parmi les Campylobacter spp présentant une croissance à 42°C, certaines espèces constituent le groupe des thermotolérants dont les plus fréquemment rencontrés sont les Campylobacter jejuni et les Campylobacter coli[/]. Cependant d’autres espèces ont été décrites ; les caractéristiques données dans le tableau ci-dessous permettent de les différencier.

Selon l’interprétation des résultats, indiquer la présence ou l’absence de [i]Campylobacter thermotolérants dans une prise d’essai de x g ou x ml de produit.