ACETOINE (Bacillus)
Certaines bactéries sont capables de produire de l’acétylméthyl-carbinol (AMC ou acétoïne) :
- soit directement à partir de deux molécules d’acide pyruvique,
- soit le plus souvent, au cours de la fermentation 2-3 butylène-glycolique après passage par l’acétolactate et le diacéthyl.
En présence de base forte, l’acétoïne donne une coloration rouge en milieu très oxygéné (oxydation en diacéthyl).
CH3 – CHOH – CO – CH3 -------- CH3 – CO – CO – CH3
FORMULE (en g/l d’eau distillée)Protéose peptone 7
Glucose 5
Sodium chlorure 5
pH = 7,0
Répartir en tubes de 18 x 180 à raison de 5 ml par tube.
Stérilisation : 15 min à 121°C.
Après ensemencement avec la souche à identifier et incubation 24 à 48 heures à 30°C, la lecture s’effectue par la
méthode d’O’Meara.
LECTUREA 0,5 ml de culture, ajouter une pincée de créatine et 0,5 ml d’une solution de soude à 40%. Agiter quelques minutes. Une réaction positive se traduit par l’apparition d’une coloration allant du
rose au rouge dans les 2 à 5 minutes (rarement dans les 10 minutes).
A.D.N. Gélose (pour la recherche de la Dnase)
Certaines bactéries sont capables d’hydrolyser
l’acide désoxyribonucléique grâce à une enzyme, la DNase, dont la recherche a longtemps été limitée à l’étude du genre Staphylococcus ; mais actuellement les applications de ce test s’étendent à d’autres genres (exemples : Moraxella, Serratia….).
La gélose à l’acide désoxyribonucléique (ADN) est un milieu solide qui permet la recherche de la
désoxyribonucléase des bactéries.
En 1956, WECKMAN et CATLIN montrèrent une corrélation entre l’augmentation de l’activité Dnase de Staphylococcus aureus et l’activité coagulase. Ils suggérèrent que cette capacité puisse être utilisée pour rechercher les Staphylocoques potentiellement pathogènes. DiSALVO confirma ces résultats en obtenant une excellente corrélation entre ces deux activités chez les Staphylocoques d’espèces isolées cliniquement.
JEFFRIES, HOLTMAN et GUSE incorporèrent du DNA dans un milieu gélosé afin d’étudier la production de Dnase chez diverses bactéries et moisissures.
Les colonies produisant la DNase hydrolysent dans leur voisinage immédiat l’acide désoxyribonucléique (ADN) contenu dans le milieu nutritif sous forme dissociée, en un mélange de mononucléotides et de polynucléotides à chaîne courte. Si l’on acidifie ensuite avec HCl 1N, l’ADN non dissocié précipite en opacifiant le milieu nutritif, alors que le pourtour des colonies DNase-positives apparaissent
translucides.
Comme autre indice de différenciation des Staphylocoques, il peut être recherché la capacité de
fermentation du mannitol avec formation d’acide lorsque nous ajoutons, lors de la préparation du milieu nutritif, du mannitol et un indicateur de pH.
L’addition de vert de méthyle à 0,05 g /l de milieu permet une meilleure visualisation. Sur ce principe, SMITH, HANCOCK et RHODEN purent détecter des Staphylocoques, des Streptocoques et Serratia. Dans ce cas, HCl ne doit pas être ajouté, une zone claire autour des colonies révèle la présence d’une activité Dnase.
FORMULE (en g/l d’eau distillée)Peptone pancréatique de caséine 15
Peptone papaïnique du soja 5
Acide désoxyribonucléique 2
Sodium chlorure 5
Agar 15
[centrer]pH = 7,3 (environ)[/centrer]
Porter à ébullition jusqu’à dissolution complète.
Stériliser à 121°C à l’autoclave pendant 15 minutes.
Mélanger et couler en boîtes de Petri.
Addition du mannitol : avant la stérilisation, ajouter au milieu nutritif liquide, et bien mélanger : 10 g de mannitol et 0,025 g de bleu de bromothymol ou 0,025 g de rouge de phénol.
UTILISATIONPrélever les colonies à tester et les ensemencer à la surface de la boîte en strie unique de 2 cm de longueur ou plages de 1 cm de diamètre. Plusieurs souches peuvent être repiquées sur une même boîte en étalements parallèles ou par secteurs.
Incuber pendant 18 à 24 heures à 37°C ou à la température de croissance optimale requise
LECTUREAprès incubation, rechercher d’abord, s’il y a lieu, la fermentation du mannitol.
- Colonies jaunes avec un pourtour jaune :
souche mannitol + ;
- Colonies incolores ou de la couleur du milieu :
souche mannitol .
Utilisation du mannitol (avec rouge de phénol)
DNase Révélation HCl 1N - DNase Révélation bleu de toluidine 0.1%
Inonder ensuite les boîtes avec une solution d’acide chlorhydrique normal
On peut observer, dans les cinq minutes qui suivent, les aspects suivants :
• zone claire autour de la strie, le reste de la boîte étant opaque :
souche DNase + ;
• absence de zone claire autour de la strie :
souche Dnase -.
N.B. : L’activité Dnase peut être aussi révélée par du bleu de toluidine (solution à 0.1%). Ce dernier peut être inclus dans la gélose (voir gélose LACHICA) soit utilisé comme l’HCl 1N, en tant que révélateur après culture. Nous pouvons observer, dans les cinq minutes, l’aspect suivant :
• zone rose autour de la strie, le reste de la boîte reste bleu :
souche Dnase + ;
• absence de zone rose autour de la strie :
souche Dnase -.
D’une manière générale, les souches de Staphylocoques qui possèdent une coagulase ont également une désoxyribonucléase. Ce milieu convient aussi parfaitement pour confirmer un diagnostic de
Serratia marcescens ou
proteomaculans subsp proteomaculans (liquefaciens) , entérobactéries Dnase +.
ALOA Listeria Agar
Le milieu ALOA ou Agar Listeria selon OTTAVIANI et AGOSTI est destiné à l’isolement et au dénombrement de
Listeria spp. Dans les aliments ou tout autre type de prélèvement. Il permet également la détection spécifique de
Listeria monocytogenes.
Sur ce milieu, les
Listeria apparaissent comme des colonies rondes, régulières, de couleur bleue à bleue vert (détection de la β- glucosidase grâce à un substrat chromogénique spécifique).
Les colonies de
Listeria monocytogenes présente un halo opaque qui permet de les différencier aisément des autres espèces de Listeria. Ce halo est lié à l’activité d’une phospholipase impliquée dans le processus infectieux de cette bactérie.
La sélectivité est obtenue par l’action combinée du chlorure de lithium et des antibiotiques et antifongiques contenus dans le milieu.
Ce milieu commercialisé par la société AES a reçu la validation AFNOR. La méthode de référence pour la recherche de
Listeria monocytogenes (NF EN ISO 11290-1) présente l’inconvénient de nécessiter jusqu’à 7 jours et peut s’avérer peu sensible dans le cas d’aliments contaminés avec d’autres espèces de Listeria.
FORMULE (en g/l d’eau distillée) Peptones 26.00
Extrait de levure* 8.00
Facteurs de croissance 4.20
Sodium chlorure 5.00
D-sodium phosphate 2.50
Lithium chlorure 10.00
X-glucoside 0.05
Substrat L.M 20.00
Agents sélectifs 0.15
Agar 15,00
pH = 7,2
Ce milieu est commercialisé prêt à l’emploi, réparti en boîtes de Petri.
UTILISATION ET LECTUREEnsemencer les boîtes directement à partir de l’échantillon ou à partir d’une culture en bouillon d’enrichissement. Dans ce dernier cas, la prise d’essai initiale sera de 25 g dans le cas d’un produit solide ou 25 ml dans le cas d’un produit liquide. Celle-ci est placée dans 225 ml de Fraser demi pour une durée de 24 heures à 30°C.
Incuber l’ensemble à 37°C pendant 24 heures.
Noter l’aspect des colonies :
-
Listeria spp : colonies bleues à bleu-vert, rondes, régulières, sans halo opaque, de 1 à 2 mm de diamètre.
-
Listeria monocytogenes : colonies typiques de
Listeria spp entourées d’un halo opaque.
Prolonger l’incubation à 37°C pendant 12 à 24 heures supplémentaires en cas d’absence de colonies typiques ou de halo douteux.
LIMITES ET PRECAUTIONSLes souches de
Listeria monocytogenes formant classiquement des colonies typiques après 24 heures d’incubation ne doivent pas faire l’objet de tests de confirmation supplémentaires.
Les souches qui présentent un halo douteux après 24 heures d’incubation doivent être réincubés et faire l’objet d’une confirmation rapide. Elles peuvent être testées vis à vis d’une aminopeptidase spécifique par une méthode sur disque imprégné d’aminoacyl-béta-naphtyamide dont l’hydrolyse est révélée par le diéthylaminobenzaldéhyde et par une couleur jaune.
Listeria monocytogenes ne possède pas cet enzyme. Ce test ressemble au test DIM de la galerie API Listeria.
Le même type de confirmation doit être opéré sur les colonies qui n’apparaissent typiques qu’après 36 à 48 heures d’incubation. Après 48 heures d’incubation, quelques souches de
Listeria ivanovii forment le même type de colonies que
Listeria monocytogenes La mise en œuvre du test de confirmation permet de facilement différencier les deux souches.
AMIDON Gélosé
Il est important de différencier les recherches :
-
de la fermentation de l’amidon soluble et des dextrines, qui se fait en milieu liquide selon la technique habituelle de mise en évidence d’une acidification ;
-
de l’hydrolyse de l’amidon qui est effectuée en gélose à l’amidon et objectivée par une zone d’éclaircissement autour de la culture sur milieu d’aspect opalescent ou par une zone de non-colorationn par les réactifs spécifiques à l’iode.
FORMULE (en g/l d’eau distillée) Peptone 10
Extrait de viande 5
Sodium chlorure 5
Amidon de riz 10
Agar 15
pH = 7,0
On peut préparer à froid une suspension à 10% d’amidon de riz qui sera chauffée avec précaution afin d’obtenir un gel qui peut être mélangé plus facilement de façon homogène à la gélose en surfusion (soit 100 ml pour 1 litre).
Répartir en tubes ou en flacons.
Stériliser à 110°C pendant 30 min.
UTILISATIONAvant l’emploi, sécher la surface de la boîte de Petri.
Ensemencer par points, «spots », de 3 à 5 mm de diamètre (sept souches peuvent être testées sur une même boîte).
Incuber, en général à 30°C (
Pseudomonas, Bacillus).
Observer pendant 5 jours.
LECTUREL’hydrolyse de l’amidon se traduit par une zone d’éclaircissement le plus souvent directement visible ; la lecture peut être rendue plus nette en versant sur la surface du milieu quelques gouttes de Lugol qui colore en bleu-marron foncé les zones où il n’y a pas hydrolyse.
Cette étude est particulièrement intéressante pour la différenciation des espèces à l’intérieur des genres
Pseudomonas (90% des souches de Pseudomonas stutzeri possèdent cette enzyme),
Sphingomonas paucimobilis (
Pseudomonas paucimobilis) hydrolyse lentement l’amidon,
Flavobacterium (seuls les
Flavobacterium du groupe II b sont amylase-positifs) et
Bacillus. Il faut noter la présence d’une amylase chez
Serratia.
Révélation hydrolyse de l’amidon avec le lugol
A.P.P. Gélose (Gélose à la phénylalanine
La gélose à la phénylalanine est un milieu solide utilisé pour l’identification de certaines entérobactéries (en particulier Proteus et Providencia).
Il permet la recherche de la
transformation de la phénylalanine en acide phényl-pyruvique[/] (APP) par la [b]phénylalanine désaminase, le phénylpyruvate formé donne une teinte verte en présence de fer trivalent. Cette enzyme est toujours couplée avec la
tryptophane-désaminase.
FORMULE (en g/l d’eau distillée) DL-Phénylalanine 2
Extrait de levure 3
Sodium chlorure 5
Di-potassium hydrogénophosphate 1
Agar 12
pH = 7,3
Chauffer lentement en agitant fréquemment, puis porter à ébullition jusqu’à complète dissolution.
Répartir à raison de 5 ml environ par tube de 18 x 180.
Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 20 minutes.
Laisser refroidir en position inclinée pour obtenir une longue tranche.
UTILISATION ET LECTURE Ensemencer largement le germe à étudier.
Incuber 18 à 24 heures à l’étuve à 37°C.
La lecture peut être effectuée selon deux méthodes :
a) Technique classique : Recouvrir la culture obtenue :
- soit avec 5 ou 6 gouttes du réactif suivant :
Solution à demi-saturation d’alun de fer 5 ml
Ammonium sulfate 2g
Acide sulfurique à 10% 1 ml
- soit avec 5 ou 6 gouttes d’une solution au 1/3 de perchlorure de fer.
Faire passer plusieurs fois le réactif à la surface de la culture. L’apparition rapide d’une coloration vert franc caractérise la transformation de la phénylalanine en APP.
b) Technique rapideA partir d’une culture sur milieu gélosée, âgée de 18 à 24 heures, [b]faire une suspension aussi dense que possible[/] dans 6 gouttes d’eau physiologique, y ajouter 6 gouttes de solution stérile à 0,5% de L-phénylalanine.
Agiter pendant 30 minutes. Ajouter 1 à 2 gouttes de solution diluée de chlorure ferrique (FeCl3) : un virage net du blanc laiteux au vert olive est observé en cas de recherche positive. La coloration reste stable pendant quelques minutes.
Comme pour la Tryptophane désaminase (TDA),
Proteus et
Providencia donnent une réaction positive.
Jeu 21 Sep - 6:43
