GELATINE AU CHARBON
Les disques de gélatine au charbon permettent
la détection de la gélatinase chez les bactéries.
Les disques sont préparés selon
la méthode de Kohn, constitués de gélatine formolée à laquelle on a ajouté du charbon finement pulvérisé. Ainsi traitée, la gélatine est stable à 37°C et son attaque se traduit par la libération de particules de charbon qu’il est facile de remettre en suspension dans le milieu.
Leur utilisation est particulièrement recommandée pour l’identification des germes liquéfiant lentement la gélatine (
Arizona par exemple). La réaction peut être lue en quelques jours au lieu de plusieurs semaines avec la méthode classique de liquéfaction de la gélatine en tube. Pour les germes très gélatinolytiques, le résultat est souvent obtenu en quelques heures.
PREPARATION DES DISQUES DE KOHNCes disques sont commercialisés mais il est possible de préparer soi-même la gélatine au charbon que l’on découpe alors pour plus de facilité, en cubes.
1) PREPARATIONGélatine 15 g
Eau 100 ml
Chauffer au bain-marie jusqu’à dissolution complète. Laisser refroidir à 45°C et ajouter, en mélangeant activement, 4 g de charbon de bois en poudre fine.
Couler dans des moules sur une épaisseur de 0,5 cm. On peut utiliser des couvercles de boîtes en plastique enduites de vaseline.
Laisser solidifier puis porter 1/2 heure au réfrigérareur.
Démouler et faire séjourner les plaques pendant 24 heures dans la solution de formol suivante:
Formol à 40% 1 vol
Eau 69 vol
Découper en cubes et laver à l’eau courante 24 à 48 heures pour éliminer le formol.
Introduire les cubes dans des flacons contenant de l’eau distillée. Tyndalliser en chauffant 1/2 heure à 100°C pendant 3 jours de suite
UTILISATION1) METHODE DE KOHNMettre dans un tube à hémolyse, 2 ml d’eau physiologique stérile ( le bouillon nutritif est à éviter car il exerce une activité inhibitrice sur la protéolyse).
Réaliser une suspension très dense du germe. Prélever avec une pince stérile un disque de gélatine au charbon et le déposer dans la suspension microbienne très dense.
Ajouter 1 à 2 gouttes de toluène. Fermer hermétiquement (bouchon de caoutchouc). Placer à l’étuve à 37°C et observer après quelques heures, puis tous les jours, pendant 8 jours.
2) METHODE DE LAUTROPDes résultats plus rapides peuvent être obtenus avec une solution 0,01 M de chlorure de calcium dans l’eau physiologique; l’ion calcium paraissant essentiel à la production de la gélatinase chez certains germes. Ajouter une goutte de toluène * et incuber comme ci-dessus.
* La suppression du toluène peut être envisagée dans certains cas, notamment pour les bacilles Gram-négatifs, aérobies stricts; certaines souches attaqueraient préférentiellement le toluène avant de dégrader la gélatine.
LECTURELa liquéfaction se manifeste par l’apparition de particules de charbon qui sédimentent au fond du tube, puis le disque se désagrège complètement avec
formation d’un nuage noir.
GELATINE NUTRITIVE
La gélatine nutritive est un milieu utilisé pour
la production de la gélatinase par certains germes.
Les micro-organismes qui dégradent la gélatine provoquent une liquéfaction du milieu.
FORMULE (en g/l d'eau distillée)
Peptone : 10.0
Extrait de viande: 4.0
Sodium chlorure: 2.5
Gélatine 120,0
pH= 6.8-7.0
Mélanger les ingrédients en chauffant jusqu’à liquéfaction complète de la gélatine.
Répartir en tube à raison de 10 ml/tube.
Stérilisation pendant 10 minutes à 115°C.
UTILISATION ET LECTURE
Pratiquer l’ensemencement par piqûre centrale.
Mettre les tubes à incuber à la température désirée.
Dans ces conditions, certains germes liquéfient la gélatine en des temps variables et sous des formes différentes (en clou, en cupule, en doigt de gant, en entonnoir, etc…), d’autres ne la liquéfient pas, mais donnent des cultures le long du trait d’ensemencement.
Si l’incubation est pratiquée à 37°C ou plus, la gélatine est liquide et il convient de refroidir les tubes avant de les examiner.
GELOSE BLANCHE
Gélose à l’eau employée dans la technique de
dénombrement en double couche et pour obturer les tubes de milieu liquide.
La gélose blanche est préconisée dans les normes :
- AFNOR V08-011 (ISO 4833) , NF V 59-101 concernant le dénombrement des microorganismes par
comptage des colonies obtenues à 30°C ;- NF V 04-506 pour le dénombrement des microorganismes dans les viandes et les produits à base de viande par la méthode de comptage des colonies obtenues à 25°C,
- NF V08-051 relative à la méthode de routine pour le dénombrement des microorganismes par comptages des colonies obtenues à 30°C ;
- NF V08-053 concernant le dénombrement des
Escherichia coli beta-glucuronidase positive par comptage des colonies à 44°C ,
- NF V 08-405 qui traite de la recherche des
Clostridium thermophiles dans les conserves,
- NF V 08-407 pour le dénombrement des spores thermorésistantes de
Bacillus et de
Clostridium thermophiles dans les conserves par la méthode du NPP,
- FIL internationale 146 :1991, concernant l’
identification des microorganismes caractéristiques du yaourt..FORMULE (en g/l d'eau distillée)
Agar : 12 à 18
(selon pouvoir gélifiant)
pH= 7.0
Dissoudre la gélose en portant à ébullition.
Répartir en tubes à raison de 4 à 5 ml par tube.
Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes.
UTILISATION
La gélose blanche liquéfiée et ramené à 45°C au bain-marie, est coulé à la surface du premier milieu ensemencé et solidifié.
Il peut être conseillé de verser une quantité plus importante de gélose blanche (environ 8 ml) lorsqu’il est soupçonné la présence de germes envahissants tels les
Proteus ou
Bacillus.
GELOSE GLUCOSEE
Ce milieu présente des formules différentes selon l’emploi qu’il en est fait.
La première formule est utilisée comme milieu de base pour les cas généraux dans la
recherche des Bacillus thermophiles .
Les
Bacillus thermophiles sont des micro-organismes sporulés, GRAM positif en culture jeune, se développant en aérobiose à 55°C, catalase positive (bien que certaines souches donnent une catalase faible ou tardive), lorsque l’essai est exécuté selon la norme.
Il fait l’objet d’une recommandation dans le norme AFNOR NF V 08-404.
La deuxième formule est préconisée comme milieu de confirmation
( essai de fermentation) dans les directives générales
pour la recherche des Enterobacteriaceae après pré-enrichissement – Norme AFNOR 08-025 (ISO 8523).
FORMULE (en g/l d'eau distillée)
1ère formuleTryptone: 4
Tryptose: 4
Sojatone: 3
Extrait de levure: 4
Sodium chlorure: 5
Glucose: 5
Amidon soluble: 1
Agar 12 à 18*
pH= 6.1
* selon le pouvoir gélifiant de l’agar.
Dissoudre les composants et ajuster le pH.
Dans le cas de l’étude de produits à pH<4,5, le pH peut être ajusté, après stérilisation, avec de l’acide lactique ou citrique.
Répartir le milieu de culture par quantités de 10 ml dans des tubes.
Stériliser à 121°C pendant 15 min.
2ème formuleTryptone: 10.000
Extrait de levure: 1.500
Glucose: 10.000
Sodium chlorure: 5.000
Bromocresol pourpre:0.015
Agar 8 à 18*
pH= 6.1
*selon pouvoir gélifiant de l’agar
Dissoudre les ingrédients en chauffant si nécessaire.
Répartir le milieu de culture par quantités de 15 ml dans des tubes.
Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 20 min.
Maintenir les tubes en position verticale.
Le milieu peut être conservé 1 semaine au maximum entre 0°C et +5°C.
Juste avant emploi, chauffer dans de l’eau bouillante ou sous courant de vapeur pendant 15 minutes, puis refroidir rapidement à la température d’incubation.
UTILISATION
1) Recherche des bacillus thermophiles (NF V08-4-404)Les essais préliminaires pour la recherche des
Bacillus thermophiles sont spécifiés dans Bouillon Glucosé p. 25. A partir des tubes de bouillon glucosé positifs, effectuer :
• Essai de culture en aérobiose et recherche de la catalase A partir des milieux de culture ensemencés (formes végétatives et/ou sporulées) présentant un développement microbien, ensemencer en stries deux boîtes de Petri de milieu de culture gélosé ( de préférence milieu au jus de tomate) l’une après l’autre en se servant de la même anse.
Incuber à 55°C pendant 18 à 24 heures
Observer la présence ou l’absence de colonies. Les souches de
Bacillus thermophiles ont parfois des difficultés de croissance, ce qui peut rendre l’observation des colonies difficile.
Lorsqu’il y a présence de colonies, les repérer selon leur type morphologique, émulsionner une colonie isolée, pour chaque type, dans un tube à hémolyse contenant 1 ml d’eau stérile ; y ajouter 2 à 3 gouttes du réactif pour la recherche de la catalase. La formation de bulle de gaz indique la présence d’une catalase.
2) Recherche des Enterobacteriaceae (NF V08-025)A partir des colonies caractéristiques prélevées sur VRBG et amplifiées sur gélose nutritive, les essais de confirmation sont effectués :
- essai à l’oxydase,
- essai de fermentation : repiquer les souches sélectionnées par piqûre à l’aide d’un fil droit dans les tubes de milieu glucosé.
Incuber pendant 24 heures à 35°C ou 37°C (selon accord).
Si une couleur jaune se développe dans la totalité du contenu du tube, la réaction est considérée comme positive.
Expression des résultatsSi l’une des colonies caractéristiques est oxydase-négative et glucose-positive, la prise d’essai doit être considérée comme renfermant des
Enterobacteriaceae.Selon les résultats obtenus aux essais de confirmation, indiquer « présence ou absence d’
Enterobacteriaceae, selon la quantité examinée dans x g de produit ».
GELOSE NUTRITIVE
La gélose nutritive est un milieu qui convient à la culture
des germes ne présentant pas d’exigences particulières.C’est un milieu particulièrement recommandé dans les normes française pour les
repiquages des colonies caractéristiques à partir des milieux sélectifs (exemple : norme NF V08-017 relative aux directives générales pour le
dénombrement des coliformes fécaux et d’Escherichia coli : repiquage sur gélose nutritive des colonies caractéristiques obtenues sur EMB, afin de réaliser ultérieurement le
test IMViC).FORMULE (en g/l d'eau distillée)
Peptone: 5
Extrait de viande: 1
Extrait de levure: 2
Sodium chlorure: 5
Agar: 12
pH=7.4
Distribuer en tubes ou en flacons.
Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes.
NB :
On se méfiera des appellations commerciales : sous des noms presque identiques :
Bouillon nutritif peptoné, gélose nutritive, Bouillon nutritif n°2 , etc., se cachent des formules très différentes ; en revanche, des milieux de formules identiques peuvent être commercialisées par plusieurs firmes sous des appellations diverses.
Il faut lire attentivement la formule d’un milieu avant d’en faire le choix, afin d’envisager non seulement les possibilités mais aussi les limites d’utilisation.
GÉLOSE SULFITÉE AU CITRATE DE FER
Ce milieu est préconisé comme milieu de base pour les cas généraux dans la recherche des
Clostridium thermophiles dans les conservesLes
Clostridium thermophiles sont des microorganismes sporulés se développant uniquement en anaérobiose à la température de 55°C, lorsque l’essai est réalisé selon la norme.
Il fait l’objet d’une recommandation dans la norme AFNOR NF V 08-405.
FORMULE (en g/l d'eau distillée)
Tryptone: 10.0
Sodium métabisulfite: 0.5
Fer citrate: 0.5
Agar 12 à 18*
pH= 7.2
*selon pouvoir gélifiant de l’agar.
Dissoudre les composants et ajuster le pH avec de l’acide lactique ou de l’acide citrique.
Répartir le milieu de culture par quantités de 12 ml dans des tubes.
Stériliser à 121°C pendant 15 min.
UTILISATION ET LECTURE
Juste avant emploi, régénérer les tubes au bain-marie bouillant pendant 20 minutes. Laisser refroidir à environ 45°C.
Recherche des Clostridium thermophiles (NF V 08-405)-
Recherche des formes végétativesOn utilise généralement 1 g ou 1 ml de produit pour 10 ml de milieu.
Ensemencer à raison de trois tubes par milieu de culture préalablement désaéré, puis refroidir rapidement dans un bain d’eau froide après avoir homogénéisé l’inoculum dans le milieu sans y introduire de l’air.
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Recherche des formes sporuléesEnsemencer comme précédemment puis plonger pendant 10 minutes les tubes dans un bain d’eau bouillante.
Il convient de veiller à ce que le niveau de l’eau du bain soit supérieure au niveau du milieu de culture dans les tubes.
Retirer ensuite les tubes et les refroidir sous courant d’eau froide.
Cette technique a été choisie en raison de sa facilité et de son efficacité : toute croissance bactérienne est due à la présence de spores thermorésistantes dans l’inoculum.
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Incubation des milieux de culturePlacer les tubes de milieu de culture ensemencés à l’étuve à 55°C.
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LectureObserver chaque jour les tubes, afin de déceler l’apparition de culture. En l’absence de culture, prolonger l’incubation pendant 8 jours.
Sortir les tubes de l’étuve dès l’apparition de colonies dans la gélose (colonies noires s’il s’agit de
D. nigrificans.):
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Résultats des ensemencements•
CAS 1 : aucun développement de bacilles n’est mis en évidence dans les milieux de culture ensemencer :
pas d’essai de confirmation à effectuerAbsence de Clostridium thermophiles•
CAS 2 : aucun développement dans la recherche des formes végétatives, mais un développement est mis en évidence dans la recherche des formes sporulées :
effectuer les essais de confirmation sur la mise en évidence du caractère anaérobie•
CAS 3 : un développement est mis en évidence dans la recherche des formes végétatives, mais aucun développement dans la recherche des formes sporulées :
effectuer les essais de confirmation sur la mise en évidence de l’aptitude à la sporulation ainsi que ceux sur la mise en évidence du caractère anaérobie.•
CAS 4 : Un développement est mis en évidence dans les deux recherches (formes végétatives et sporulées) :
effectuer à partir de la recherche des formes végétatives tous les essais de confirmation et à partir de la recherche sur les formes sporulées, les essais de confirmation sur la mise en évidence du caractère anaérobie[u]