D

La gélose au désoxycholate-citrate-lactose (D.C.L.) est un milieu sélectif destiné à l’isolement des Salmonella et des Shigella. Il inhibe la croissance des bactéries à Gram positif et partiellement celle de nombreuses entérobactéries (ex : Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter).

A l’origine, LEIFSON développa ce milieu par l’utilisation de produits chimiquement définis qui lui permirent de mieux pouvoir en contrôler la sélectivité. La formule actuelle, modifiée, représente une des nombreuses variantes de gélose au désoxycholate citrate. Elle contient une forte concentration en substances inhibitrices.

L’inhibition de la flore Gram-positive est due à la présence du désoxycholate, du citrate de sodium et du citrate ferrique.
La sélectivité du milieu permet d’ensemencer largement, sans crainte de voir les colonies de Salmonella ou de Shigella masquées par des contaminants.
Les coliformes non inhibés fermentent le lactose. L’acidification résultante provoque la précipitation de dérivés biliaires autour des colonies et le virage au rouge de l’indicateur de pH : le rouge neutre.
Les germes lactose-négatifs présentent des colonies incolores.
Par réduction du citrate ferrique ammoniacal, les microorganismes producteurs de sulfure d’hydrogène se manifestent par un noircissement qui est dû à l’apparition du sulfure de fer au centre des colonies.

Il est préconisé comme milieu d’isolement sélectif dans la norme NF 08-013 concernant la méthode de recherche des Salmonella ainsi que dans la norme V 08-052 sur la méthode de routine pour la recherche des Salmonella.

FORMULE (en g/l d’eau distillée)
.
Peptone bactériologique 5.00
Extrait de viande 5.00
Sodium citrate 8.50
Sodium thiosulfate 5.40
Fer citrate (ferrique) 1.00
Sodium désoxycholate 5.00
Lactose 10.00
Rouge neutre 0.02
Agar 12,00


Porter à ébullition jusqu’à dissolution complète en agitant fréquemment. Refroidir à 50°C. Il est indispensable d’effectuer la mesure de la quantité d’eau distillée à employer, après ébullition et refroidissement. En effet, lorsque la mesure est effectuée avant ce traitement, l’évaporation entraîne une perte d’eau : la concentration du milieu n’est plus respectée, ce qui provoque une inhibition anormale des cultures. NE PAS AUTOCLAVER.

Couler en boîtes de Petri.

UTILISATION

Le milieu au désoxycholate citrate lactose (D.C.L.) est habituellement utilisé pour l’isolement des Salmonella et des Shigella à partir de produits divers. A ce titre, il peut être utilisé dans le cadre de la recherche des salmonelles dans les produits alimentaires après enrichissement sur :

- milieu au sélénite de sodium ;
- milieu RV : bouillon au vert malachite au chlorure de magnésium ou
- milieu Rappaport Vassiliadis.

Mettre à l’étuve à 37°C pendant 24 heures. Si, après ce temps d’incubation, aucune colonie ne s’est développée sur aucune boîte, il est nécessaire de recommencer les isolements à partir des milieux d’enrichissement.

LECTURE

Après 36 à 48 heures d’incubation, les colonies se présentent le plus souvent sous les aspects typiques décrits dans le tableau page 62 (. tableau comparatif des résultats comparés avec ceux obtenus à partir du milieu D.C.L.S.)

Cependant, après 24 heures d’incubation seulement, nous pouvons différencier sans difficulté les colonies Lactose - et les colonies Lactose +.




La gélose au désoxycholate-citrate-lactose-saccharose (D.C.L.S.) est un milieu sélectif destiné à l’isolement des Salmonella et des Shigella. Il inhibe la croissance des bactéries à Gram positif et partiellement celle de nombreuses entérobactéries (ex : Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Proteus.).

A l’origine, LEIFSON développa ce milieu en utilisant des produits chimiquement définis (citrate et désoxycholate de sodium) qui lui permirent de mieux pouvoir en contrôler la sélectivité. La formule actuellement modifiée représente une des nombreuses variantes de gélose au désoxycholate citrate. Elle contient une forte concentration en substances inhibitrices et se distingue de la gélose au désoxycholate citrate lactose par l’incorporation de saccharose.

L’inhibition de la flore Gram-positive est due à la présence de désoxycholate ainsi que de deux citrates de sodium et de fer. Les coliformes sont presque totalement inhibés. Cependant, les colonies qui se développent peuvent fermenter le saccharose plus rapidement que le lactose, permettant ainsi d’éliminer les réactions faussement positives. L’acidification consécutive aux fermentations sucrées provoque la précipitation des dérivés biliaires autour des colonies et le virage au rouge de l’indicateur de pH : le rouge neutre.
La présence de saccharose permet la différenciation de colonies lactose et saccharose-négatives (Salmonella, Shigella et Arizona) par rapport aux flores lactose-négatives, mais saccharose-positives, comme par exemple Proteus vulgaris, Serratia, etc..

Les germes lactose-négatifs présentent des colonies incolores ou très légèrement rosées.
Par réduction du citrate ferrique ammoniacal, les microrganismes producteurs de sulfure d’hydrogène se manifestent par un noircissemnt qui est dû à l’apparition de sulfure de fer autour des colonies.

Ce milieu peut être également utilisé pour l’isolement de Vibrio cholerae. Les bacilles pathogènes de Yersinia, par exemple, Yersinia pestis et Yersinia tuberculosis peuvent s’y développer.

La gélose D.C.L.S. peut être ensemencée directement à partir du produit à analyser ou après un enrichissement des Salmonella dans un bouillon sélénite par exemple.

FORMULE (en g/l d’eau distillée)

Peptone bactériologique 7.00
Extrait de viande 3.00
Sodium citrate 10.50
Sodium thiosulfate 5.40
Sodium désoxycholate 2.50
Lactose 5.00
Saccharose 5.00
Rouge neutre 0.03
Agar 12,00


Porter à ébullition jusqu’à dissolution complète en agitant fréquemment. Refroidir à 50°C et couler en boîte de Petri. NE PAS AUTOCLAVER.

Il est indispensable d’effectuer la mesure de la quantité d’eau distillée à employer, après ébullition et refroidissement. En effet, lorsque la mesure est effectuée avant le traitement, l’évaporation entraîne une perte d’eau ; la concentration du milieu n’est plus respectée, ce qui provoque une inhibition anormale de certaines bactéries recherchées.

Ces boîtes peuvent être utilisées dès leur préparation ou conservées quelques jours au réfrigérateur.

UTILISATION

La gélose D.C.L.S. est souvent utilisée pour l’isolement des Salmonella à partir des milieux d’enrichissement (Bouillon au sélénite, Bouillon Rappaport Vassiliadis, etc.), lors de la recherche de ces bactéries dans les produits alimentaires.

Agiter soigneusement chaque milieu d’enrichissement et procéder à un isolement à la surface d’un milieu D.C.L.S. et d’un autre milieu sélectif (gélose V.B.R.P., gélose S.S., gélose au vert brillant, etc.)

Ces repiquages doivent de préférence, être répétés après 24 puis 48 et éventuellement 72 heures d’incubation à 35-37°C pour le bouillon au sélénite et à 42°C pour le bouillon Rappaport Vassiliadis.

Incuber les boîtes en les retournant pendant 24 et 48 heures à 37°.

LECTURE

- Colonies rouges = germes fermentant le lactose ou le saccharose.
- Colonies transparentes = germes ne fermentant aucun des deux sucres.
- Colonies rosées = germes fermentant lentement l’un des deux sucres.
- Colonies incolores ou blanchâtres = Salmonella
- Colonies transparentes ou légèrement rosées = Shigella
Les colonies suspectes d’être des Salmonella ou des Shigella sont ensuite repiquées sur les milieux de diagnostic rapide (Milieu de Kligler ou gélose T.S.I.), voire une galerie d’identification.




Outre le milieu Plate Count Agar (PCA) utilisé dans la plupart des méthodes de dénombrement des microrganismes, il existe un milieu préconisé dans l’analyse des produits alimentaires et particulièrement celle des viandes et produits à base de viande.

Ce milieu, préconisé dans la norme NF V 04-506 relative au dénombrement des microorganismes par la méthode de comptage des colonies obtenues à 25°C est une variante du PCA auquel il est rajouté du pourpre de bromocrésol.

FORMULE (en g/l d’eau distillée)

Peptone 15.00
Extrait de viande 3.00
Extrait de levure 5.00
Glucose 1.00
Pourpre de bromocrésol 0.02
Agar 15,00


Dissoudre les composants en chauffant si nécessaire.
Répartir en tubes ou en flacons.
Stériliser à 121°C pendant 15 minutes.

UTILISATION

Déposer 1 ml de la suspension mère dans une boîte de Petri stérile.

Transférer dans une autre boîte de Petri, 1 ml de la première dilution décimale après avoir changé de pipette stérile.
Recommencer ces opérations pour chaque autre dilution décimale.

Couler dans chaque boîte de Petri environ 15 ml de milieu préalablement fondu et maintenu en surfusion au bain-marie à 45°C. Le temps qui s’écoule entre la fin de la préparation de la suspension mère et le contact de la dernière dilution avec le milieu ne doit pas excéder 15 minutes.

Mélanger soigneusement inoculum et milieu et laisser se solidifier sur une surface fraîche et horizontale.

Après solidification complète et si l’on suspecte le produit pouvant contenir des germes envahissants, couler à la surface du milieu 4 ml de gélose blanche. Laisser se solidifier.

Retourner les boîtes et incuber à 25°C pendant 5 jours.




Ce milieu sert à la préparation de la solution mère ou de la suspension mère ainsi qu’à ses dilutions au cours des analyses des produits alimentaires. Ce milieu est utilisé dans le cadre des normes françaises AFNOR V 08-010 (ISO 6887-1), V 08-011, V 04-015, V 04-016, V 08-201, V 08-301 et V 08-501, à moins que des preuves irréfutables (essais comparatifs) témoignent de la supériorité d’autres diluants.

Un milieu d’efficacité voisine au Peptone sel, le Tryptone sel, peut être employé (la peptone est alors remplacée par de la tryptone à quantité égale dans la composition).

L’addition de 0,033 g/l d’ester oléique de sorbitol (tween 80) est préconisée dans le dénombrement des moisissures des aliments pour animaux. Ce dénombrement correspond à la norme NF V 18-301.

FORMULE (en g/l d’eau distillée)

Digestat enzymatique de caséine 1.0
Sodium chlorure 8.5


Répartir en flacons ou en tubes
Stérilisation:20 min à 121°C

UTILISATION

Le diluant s’utilise soit pour préparer la solution mère (10% de prise d’essai dans 90% de diluant) soit pour effectuer les dilutions décimales qui en découlent. Dans tous les cas il convient de peser avec une incertitude de mesure de 5%, une masse mg ou un volume vml ( au minimum 10 g ou 10 ml, sauf spécification autre).

Ajouter une quantité de diluant égale à 9 x mg ou 9 x vml. Cette quantité peut être mesurée de préférence en masse ou en volume avec dans les deux cas une incertitude de +/-5%.
Pour éviter le stress des microorganismes, il est conseillé d’utiliser le diluant à température ambiante (sauf cas spécifiques). Si nécessaire, laisser déposer les grosses particules 15 minutes maximum ou utiliser des systèmes de filtration adéquats.

Dans le cas des dénombrements de spores, traiter à la chaleur immédiatement et refroidir aussitôt après traitement.
Préparer les dilutions décimales en transvasant 1 ml de la suspension mère dans un tube contenant 9 ml de diluant stérile (dilution 10-1). Pour une précision optimale ne pas introduire la pipette dans la suspension mère de plus de 1 cm.

Mélanger soigneusement de préférence avec un agitateur mécanique pendant 5 à 10 secondes et prélever, avec une nouvelle pipette stérile, 1 ml de la suspension 10-1 qui est placé dans 9 ml de diluant stérile (dilution 10-2). Continuer ainsi si nécessaire avec les dilutions suivantes, 10-3, 10-4….
Le temps qui s’écoule entre la fin de la préparation de la suspension mère et le moment ou l’inoculum rentre en contact avec le milieu de culture ne doit pas dépasser 45 minutes avec un maximum de 30 minutes séparant la préparation de la suspension mère au début de la préparation des dilutions décimales.

Dans le cas de la norme NF V 18-301, le diluant au tween est utilisé pour la suspension mère de la manière suivante :

1ère catégorie
Graines ou grains 100g volume du diluant: 400ml
Manioc 50g volume du diluant 450 ml
Tourteaux 50g volume du diluant 450 ml
dans un Bol de type Waring-Blendor de 1 litre

2ème catégorie
Issues de céréales 20g
Farines de luzerne 20g
autres matériaux pulvérulents riches en cellulose 20g
dans 380 m de diluant
dans un Ballon à fond plat de 1 litre + billes de verre

2ème catégorie
Autres issues 20g
Mélasses 20g
Farines animales 20g
Aliments composés 20g
180 ml de diluant
dans un Ballon à fond plat .5 litre + billes de verre

Laisser en contact la prise d’essai et le diluant pendant 25 minutes, puis procéder au broyage avec le Waring- Bendor (1ère catégorie) en réglant la vitesse de rotation de manière à obtenir 20000 tr/min sans que la température s’élève de plus de 3°C (ce qui correspond à un temps global de 1,5 min).

- pour les suspension au 1/10, transférer une dizaine de millilitres dans un tube stérile.
- Pour les suspension au 1/5 ajuster au 1/10 en transférant 5 ml dans un tube contenant 5 ml de diluant.

Les produits de la deuxième catégorie ne nécessitent pas un broyage. Laisser en contact produit et diluant pendant 20 minutes, puis homogénéiser directement au moyen d’agitation mécanique pendant 10 minutes. Transférer une dizaine de millilitres dans un tube stérile.
Préparer les suspensions dilutions suivantes en transvasant 1 ml de la solution précédente dans 9 ml de diluant. Changer de pipette entre chaque dilution.

Ce diluant est utilisé en microbiologie alimentaire en particulier pour les analyses concernant la gélatine alimentaire dont le dénombrement des micro-organismes par la méthode de comptage des colonies obtenues à 30°C (NF V 59-101), dans la norme NF V 59-102 relative à la recherche des coliformes par culture à 30°C sur milieu sélectif liquide et dans la norme NF V 59-103 concernant la recherche des coliformes fécaux par culture à 44,5°C sur milieu sélectif liquide.

FORMULE (en g/l d’eau distillée)

Di-sodium monohydrogénophosphate, 12 H2O 9.00
Potassium dihydrogénophosphate 1.5


Répartir en flacons ou en tubes.
Stériliser à 121°C pendant 20 minutes.




Pour améliorer la mise en solution d’une prise d’essai servant à la recherche des spores de Clostridium perfringens, il peut être préconisé le diluant cystéiné ; la norme NF v 59-107 relative à la recherche de ces spores dans la gélatine alimentaire en recommande l’emploi.

FORMULE (en g/l d’eau distillée)

Sodium chlorure 2.250
Potassium chlorure 0.105
Calcium chlorure 0.120
Sodium carbonate 0.050
Cystéine chlorhydrate 0.300


Dissoudre les ingrédients dans l’eau à température ambiante ou chauffer légèrement si nécessaire.
Répartir dans des flacons à raison de 180 ml par flacon.
Stériliser à 121°C pendant 15 minutes.

UTILISATION

Transférer la prise d’essai (20 g) dans le flacon contenant le diluant. Agiter pour disperser.
Laisser la gélatine absorber le diluant pendant environ 1 h à température ambiante. Ce temps peut être prolongé 3 heures si nécessaire.
Placer le flacon dans un bain d’eau réglé à 45°C pour homogénéiser la gélatine par agitation douce en la dissolvant. Le séjour dans le bain ne doit pas excéder 1 heure.
La solution au dixième ainsi obtenue peut être alors traitée.

Pour cela verser aseptiquement 25 ml de cette solution d’essai dans un tube de 22mmx220mm et porter le tube dans un bain-marie d’eau réglé 80°C pendant 10 minutes.
Refroidir rapidement sous courant d’eau froide.

Ensemencer ensuite la solution d’essai dans le milieu Lactose Sulfite (LS) en veillant à ne pas introduire d’air pendant les manipulations.



Ce milieu est un milieu courant utilisé particulièrement pour la culture des Streptocoques et des Entérocoques en vue de leur conservation.

FORMULE (en g/l d’eau distillée)

Tryptose 20.0
Extrait de levure 3.0
Sodium chlorure 5.0
Potassium hydrogénophosphate 1.0
Glucose 1.0
Agar 15.0


Répartir en tubes ou en flacons.
Stérilisation : 20 minutes à 121°C.