M

M Bouillon

Le milieu M (Mannose) est recommandé pour la détection des Salmonelles dans les aliments par un procédé sérologique à enrichissement accéléré. Ce milieu contient tous les éléments nutritifs pour une bonne croissance et un développement des flagelles de Salmonella.

FANTASIA, SPERBER et DIEBEL comparèrent les méthodes d’enrichissement sérologique avec celles reportées dans le Bacteriological Analytical Manual et trouvèrent que les premières étaient plus rapides, moins compliquées et plus fiables que les méthodes préconisées par le BAM.

Ce milieu est conforme aux méthodes standards recommandées par le Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (APHA) Les méthodes de screening décrites par l’AOAC Official Methods of Analysis font aussi référence à ce milieu.


FORMULE (en g/l d’eau distillée)

Extrait de levure: 5
Tryptone: 12.5
D-mannose: 2
Sodium Citrate: 5
Sodium chlorure: 5
Di-potassium phosphate: 5
Manganèse chlorure:0.14
Magnésium sulfate: 0.80
Fer (III) sulfate: 0.04
Tween 80: 0.75


Dissoudre par chauffage, répartir en tube et autoclaver 15 mn à 120°C.

UTILISATION ET LECTURE


Dans les tests d’agglutination des Salmonelles, procéder comme suit :

Préparer une suspension au 1/10 de microorganismes à tester dans du bouillon lactose. Incuber à 35°C ± 2°C pendant 18-24 heures,

Transférer 1 ml du pré-enrichissement dans 9 ml de bouillon sélénite cystine et 1 ml du même milieu dans 9 ml de milieu Rappaport,

Inoculer un tube de milieu M tempéré au préalable à 35°C avec une goutte de culture des milieux précédents. Incuber à 35°C ± 2°C pendant 6-8 heures.

Préparer une solution avec 4,2 g de NaCl, 3 ml de formol dans 100 ml d’eau distillée. Placer une goutte de cette solution dans deux tubes de Kahn.

Prélever soigneusement à 2 cm au dessus de la surface des tubes de culture, sans remuer, 0,85 ml de milieu M et ajouter à la solution saline.

Mélanger 0,5 ml de chacun des serums anti H Poly D et anti H Z6 dans 11,5 ml d’eau physiologique (0,85% NaCl),ajouter 0,1 ml du mélange d’antisérums à un des tubes de Kahn préparés ci-dessus, et 0,1 ml d’eau physiologique à l’autre tube. Remuer doucement.

Incuber l’ensemble à 50°C pendant 90 minutes.

L’agglutination dans le tube de Kahn contenant l’antisérum indique la présence de Salmonella.L’agglutination dans le tube contenant l’eau physiologique indique une souche auto-agglutinante qui doit être isolée à nouveau, cultivée sur milieu mobilité GI pour stimuler la formation des flagelles et retestées pour l’agglutination.

M 17

Le milieu M17 sert pour la culture et la numération des Streptocoques lactiques dans le lait et les produits laitiers, ainsi que pour la caractérisation et la différenciation des Streptocoques lactiques et de leurs bactériophages. Il est également bien adapté pour le dénombrement de Streptococcus thermophilus dans les yaourts natures ou arômatisés, brassés ou non, ainsi que dans les yaourts contenant des morceaux de fruits.

LOWRIE et PEARCE travaillèrent sur le milieu M16 qui offrait un pouvoir tampon relativement modéré. TERZAGHI et SANDINE ont montré que l’incorporation de de β-glycérophosphate de sodium à un milieu de M16 permettait d’accroître le pouvoir tampon de celui-ci.

Le nouveau milieu obtenu, dénommé M17, a permis d’augmenter le développement des streptocoques lactiques qui sont des microorganismes produisant d’importantes quantités d’acide par utilisation homofermentative du lactose

SHANKAR et DAVIES découvrirent que le β-glycérophosphate de sodium inhibait Lactobacillus bulgaricus et sélectionnait Streptococcus thermophilus dans le yaourt.

Les peptone de caséine, de viande et de soja contiennent les sources de carbone et d’azote nécessaires à la culture des lactocoques.
L’extrait de levure est une source de vitamines du groupe B.
L’acide ascorbique agit comme stimulateur de croissance.
Le lactose est fermenté en acide lactique qui est neutralisé en présence de glycérophosphate.

Lors de la culture de Streptococcus cremoris très exigeants, de Streptococcus diacetilactis et Streptococcus lactis, le milieu M17 s’est montré supérieur aux milieux habituels. Il est recommandé par l’International Dairy Federation.

L’isolement des mutants, qui ont perdu la capacité d’utiliser le lactose, est également possible.


FORMULE (en g/l d’eau distillée)

Peptone de farine de soja: 5
Peptone de viande: 2.5
Peptone de caséine: 2.5
Extrait de levure: 2.5
Extrait de viande: 5.5
D(+) lactose: 5
Acide ascorbique: 0.5
Sodium β-glycérophosphate: 19
Magnésium sulfate: 0.25
Agar (si milieu solide): 12.75


Dissoudre les composants dans l’eau en chauffant si nécessaire. Répartir le milieu en flacon ou en tubes de capacité appropriée.
Autoclaver 15 minutes à 121°C.
Les milieux sont limpides et brunâtres. Le milieu se conserve en boîtes bien fermées environ 10 jours au réfrigérateur.

UTILISATION ET LECTURE

Couler en boîte de pétri si le milieu est solide.
Ensemencer et incuber 24 heures à 30°C.

Au bout de 15 heures, les colonies de Streptocoques lactose-positives sont déjà visibles.
Les colonies de Streptocoques lactiques lactose-positive ont au bout de 5 jours un diamètre de 3 à 4 mm, les mutants de Streptocoques lactose-négatifs ont un diamètre inférieur à 1 mm.

L’attaque des phages est décelée par de grandes plages distinctes sur le milieu rendu opaque par croissance bactérienne.

MAC CONKEY au sorbitol
(CT-SMAC)

Le milieu Mac Conkey au sorbitol est un milieu préconisé par la norme européenne EN ISO 16654 : 2001 concernant la méthode horizontale pour la recherche des Escherichia coli O 157 :H7 qui est actuellement responsable des plus importantes épidémies de colites hémorragiques.
C’est un milieu dérivé de la gélose Mac Conkey utilisée pour la recherche des entérobactéries, où le lactose a été remplacé par le sorbitol.

FORMULE (en g/l d’eau distillée)

1) milieu de base
Digestat enzymatique de caséine: 17
Digestat enzymatique de viande: 3
Sorbitol: 10
Sels biliaires n°3: 1.5
Chlorure de sodium: 5
Rouge neutre: 0.03
Violet de méthyl: 0.001
Agar: 9 à 18


Dissoudre les ingrédients dans l’eau en chauffant jusqu’à ébullition.

Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 min.

2) solution de tellurite de potassium
Tellurite de potassium: 2.25
Eau distillée: 100 ml

Dissoudre le tellurite dans l’eau et stériliser par filtration sur membrane.
Cette solution peut être conservée pendant un mois à température ambiante mais ne doit pas être utilisée s’il y a formation d’un précipité blanc.

3) solution de cefixime
Cefixime: 5 mg
Eau distillée: 100 ml

Dissoudre la cefixime dans l’eau et stériliser par filtration sur membrane.
Cette solution peut être stockée pendant une semaine à 3°C  2°C.

4) milieu complet
Milieu de base: 1000 ml
Solution de tellurite de potassium: 1 ml
Solution de cefixime: 1 ml


Refroidir le milieu de base à température de surfusion. Ajouter les solutions de tellurite et de cefixime.
Mélanger et couler le milieu en boîtes de Petri stériles.
Laisser solidifier.

La concentration finale est de 2,5 mg/l pour le tellurite et de 0,05 mg/l pour la cefixime.
Faire sécher les boîtes soit dans une étuve de séchage ou sous hotte à flux laminaire.

Les boîtes non séchées peuvent être conservées à l’abri de la lumière pendant 15 jours dans des sacs plastique à 3°C  2°C.

UTILISATION

Après enrichissement de la prise d’essai dans un bouillon tryptone de soja modifié contenant de la novobiocine (mTSB + N) il est procédé à la séparation et à la concentration des microorganismes au moyen de billes immunomagnétiques revêtues d’anticorps anti E. coli O 157.
A l’aide d’une micropipette, transférer 50 µl de billes magnétiques lavées et resuspendues sur la boîte de pétri contenant le milieu Mac Conkey et 50 µl de billes sur un deuxième milieu d’isolement.
Etaler les billes à l’aide d’un anse stérile pour obtenir des colonies bien isolées sur la gélose.
Incuber la gélose CT-SMAC à 37°C pendant 18 à 24 h et incuber la seconde boîte de petri contenant al deuxième gélose sélective à la température at au temps recommandés pour ce milieu.

S’il est difficile d’apprécier la présence d’E. coli O157 à cause de la présence d’un grand nombre de flore microbienne, des dilutions de la préparation d’IMS peuvent être utilisées ou des volumes inférieurs à 50 µl peuvent être ensemencés par plaque, bien que cela entraîne une augmentation de la limite de détection.

Les colonies caractéristiques sont transparentes et presque incolores avec un aspect brun-jaunâtre clair et un diamètre approximatif d’1 mm.

Prélever 5 colonies caractéristiques dans chaque boîte, si une boîte contient moins de cinq colonies, les prélever toutes.
Isoler chaque colonie sur une boîte de gélose nutritive afin de confirmer ultérieurement celle-ci par des tests tels que la formation d’indole et l’identification sérologique.

MALONATE DE SODIUM

Le milieu au malonate, formulé par LEIFSON est un milieu liquide, destiné à étudier l’utilisation du malonate de sodium, ne permet pas la croissance de toutes les bactéries en anaérobiose puisque le malonate inhibe le cycle de Krebs (inhibition de la succinate-déshydrogénase). Seules les bactéries qui peuvent utiliser le cycle glyoxylique sont capables de pousser sur un milieu au malonate, le pouvoir inhibiteur de la succinate-déshydrogénase étant alors sans effet.

L’utilisation du malonate s’accompagne d’une libération d’ions OH alcalinisants. Le sulfate d’ammonium est la seule source d’azote et le malonate la seule source de carbone. LEIFSON à démontré que la groupe Enterobacterutilise le malonate alors que celui des Escherichia en est incapable.

Il existe des variantes de ce milieu (milieux malonate modifiés, formule de EDWARDS et EWING)) selon qu’il est additionné d’extrait de levure (1 g/l) et:ou de glucose (0,25 g/l). ces petites quantités de rajouts permettent la croissance des microorganismes qui ne pourrait pas pousser autrement, et donc d’étudier leur réponse vis à vis du malonate.

Il faut noter que l’addition de glucose ne permet plus la recherche de la production d’indole chez les Entérobactéries, Vibrio et Aeromonas.

FORMULE (en g/l d’eau distillée)

Ammonium sulfate: 2
Potassium dihydrogénophosphate: 0.4
Di-potassium hydrogénophosphate: 0.6
Sodium chlorure: 2
Sodium malonate: 6
Bleu de bromothymol: 0.025


Stériliser de préférence par filtration sur membrane et répartir aseptiquement à raison de 1 ml par tube.

UTILISATION ET LECTURE

Ensemencer ce milieu avec une culture de 18 à 24 heures, prélevée sur milieu solide.
Revisser partiellement la capsule.
Incuber à 37°C pendant 3 jours au maximum.

La grande majorité des Enterobacteriaceae malonate + alcalinisent le milieu en 24 heures.

Le malonate est utilisé quand le milieu vire du jaune-vert au bleu outremer (alcalinisation).
La recherche de l’indole à l’aide du réactif de Kovacs peut aussi être effectuée sur ce milieu.


INTERET

Ce milieu sert principalement au diagnostic différentiel des sous-genres de Salmonella :

Les Salmonella des sous-genres I et IV sont malonate -, les Salmonella des sous-genres II et III (=Arizona) sont malonate +.

Il a aussi un intérêt dans l’identification d’autres Enterobacteriaceae, par exemple :

Escherichia coli (malonate -, indole +), Proteus mirabilis (malonate -, indole -), Klebsiella pneumoniae (malonate +, indole -), Klebsiella oxytoca (malonate +, indole +), Levinea malonatica (malonate +, indole +), etc.

INTÉRÊT CHEZ LES BACTÉRIES AÉROBIES-STRICTES

MALONATE +
Ps. aeruginosa
Ps. pseudomallei
Ps. stutzeri
Ps. maltophilia
Ps. cepiaca
Ps. acidovorans
Alcaligenes odorans


MALONATE (d)
Ps. putida
Ps. fluorescens
Alcaligenes faecalis
Alcaligenes denitrificans


MALONATE -
Ps. pseudo-alcaligenes
Ps. diminuta-vesiculari
Alteromonas putrefaciens
Flavobacterium
Xanthomonas

MALT GÉLOSÉ

La gélose au malt est un milieu destiné à l’isolement, au dénombrement et à la culture des levures et des moisissures de divers produits, tout particulièrement de produits laitiers.

REDDISH en 1919, puis FULLMER et GRIMES utilisèrent l’extrait de malt pour la culture des levures en milieu synthétique. THORN et CHURCH employèrent en 1926 avec succès le milieu de Reddish pou l’étude des Aspergillus.

En milieu acide, l’extrait de malt qui est riche en glucides, apporte tous les éléments nutritifs nécessaires au métabolisme des levures et des moisissures. En outre, l’acidité du milieu inhibe le développement de la plupart des germes contaminants.

Pour limiter un développement bactérien qui gênerait la détection des moisissures, il convient d’ajouter une substance antimicrobienne à large spectre, par exemple du chloramphénicol à raison de 0,1g/litre que l’on peut introduire avant stérilisation.

Ce milieu est notamment préconisé dans la norme NF V 18-301 relative au dénombrement des moisissures dans les aliments des animaux.


FORMULE (en g/l d’eau distillée)
.
A) MILIEU A
Extrait de malt: 20
Agar: 12 à 18


B) MILIEU B
Extrait de malt: 20
Agar: 12 à 18
Sodium chlorure: 60


Dissoudre et porter à ébullition.
Répartir en tubes à raison de 15 ml par tube ou en ballon de capacité appropriée à raison d’environ la moitié du volume du ballon.
Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 20 minutes.


UTILISATION

Selon le produit à analyser préparer les suspensions essais et les dilutions comme spécifié dans la rubrique Diluant p.62.

Prendre quatre boîtes de Petri stériles. Transférer dans chacune des boîtes, à l’aide d’une pipette stérile, 1 ml de la suspension mère.

Prendre quatre autres boîtes et transférer, à l’aide d’une nouvelle pipette stérile 1 ml de la dilution au 1/100. Recommencer les opérations avec les dilutions suivantes.

Pour chaque groupe de quatre boîtes, couler dans deux boîtes 15 ml de milieu A et dans deux autres boîtes 15 ml de milieu B.
Par un mouvement de rotation, homogénéiser l’ensemble et laisser se solidifier sur une surface fraîche et plane.

Placer l’ensemble à incuber pendant 5 à 7 jours dans une étuve réglée à 25°C

Dans certains cas, notamment aliments chauffés, il est nécessaire de retenir une deuxième température d’incubation, la température de 35°C est alors recommandée. La durée d’incubation sera, dans ce cas, de 3 à 6 jours.


LECTURE ET EXPRESSION DES RÉSULTATS

Dans la mesure du possible, ne retenir pour le dénombrement que les boîtes contenant des thalles distincts (en général 5 à 50 par boîte)

NOTA : de multiples causes peuvent provoquer une discordance entre les résultats de deux dilutions successives. En conséquence, avant tout dénombrement, vérifier au moins deux dilutions (celle retenue pour le dénombrement et celle inférieure ou supérieure) que les nombres observés soient cohérents. Si tel n’est pas le cas, recommencer l’analyse).

Dans ces conditions de culture, des levures peuvent se développer, que l’on distinguera des thalles de moisissures.

Les résultats sont exprimés séparément pour chaque milieu de culture :
• Il existe, au niveau d’une seule dilution, 2 boîtes de Petri contenant entre 5 et 50 thalles distincts :
Calculer la moyenne arithmétique du nombre de thalles dénombrés dans ces deux boîtes. Multiplier cette moyenne par l’inverse du taux de dilution. Exprimer le résultat, pour le milieu considéré, par un nombre compris entre 0,1 et 9,9 multiplié par 10n, n étant la puissance de 10 qui convient.

• Il n’y a pas de dilution donnant de 5 à 50 thalles distincts par boîte :
Retenir alors les quatre boîtes (correspondant à deux dilutions successives) encadrant la fourchette de 5 à 50 thalles par boîte. Pour chaque dilution (thalles distincts ou non) calculer le nombre moyen par gramme, en procédant comme ci-dessus.
Donner comme résultat la moyenne arithmétique des deux valeurs retenues.

• Les deux boîtes, au niveau de la suspension mère contiennent moins de 5 thalles :
Donner le résultat sous la forme : moins de 5x moisissures par gramme de produit, 1/s étant le taux de dilution de la suspension mère.

• Les boîtes correspondant à la suspension mère ne contiennent aucun thalle :
Donner le résultat sous le forme : moins de 1x moisissure par gramme de produit, 1/s étant le taux de dilution de la suspension mère.

MANNITOL-MOBILITÉ- NITRATE

Le mannitol est un produit de réduction du D-mannose : c’est pourquoi nous décrirons son utilisation avec celles des glucides.
Cette dégradation conduit à la formation de fructose, dont l’attaque aboutit à des acides à chaînes très courtes (acide acétique, acide formique). Le milieu mannitol-mobilité-nitrate permet de rechercher simultanément la fermentation du mannitol, la mobilité, la réduction des nitrates en nitrites

Le nitrate de potassium présent dans le milieu inhibe l’hydrogène-lyase, donc la formation de bulles de gaz qui rendent la lecture de la mobilité difficile avec des cultures gazogènes.

Ce milieu est particulièrement indiqué pour la recherche des Salmonella, Shigella et Yersinia enterolitica dans les selles.


FORMULE (en g/l d’eau distillée)
.
Hydrolysat trypsique de caséine: 10
Potassium nitrate: 1
Mannitol: 7.5
Rouge de phénol à 1%: 4 ml
Agar: 3.5


Ce milieu faiblement gélosé doit être régénéré au bain-marie bouillant et laissé à solidifier en culot, en plaçant le tube dans de l’eau froide


UTILISATION ET LECTURE

Au moyen d’un fil de platine chargé de la semence, faire une piqûre centrale jusqu’au fond du tube. l’incubation est faite à 37°C.

Ce milieu donne trois réponses :

1) Les bacilles mobiles diffusent à partir de la ligne d’ensemencement en créant un trouble du milieu. Les bacilles immobiles cultivent uniquement le long de la strie d’ensemencement.
L’appréciation de la mobilité avec ce milieu comporte des causes d’erreurs. Cette méthode est peu sensible : des souches peu mobiles pourront apparaître immobiles.
Une fente dans la gélose peut simuler dans un plan une fausse mobilité ; il faut toujours s’assurer que la diffusion est bien homogène en tournant le tube sous tous ses angles.
En cas de doute, examiner une culture jeune (par exemple de 6 heures) en milieu liquide au microscope entre lame et lamelle.

2) Si le mannitol est fermenté, le milieu vire au jaune. Dans le cas contraire, il garde sa couleur initiale

3) En versant à la surface du milieu ensemencé quelques gouttes de réactifs de Griess, on peut rechercher la réduction des nitrates en nitrites (Voir bouillon nitrate)


NB : une bactérie aérobie stricte dénitrifiante (exemple : Pseudomonas denitrificans, Pseudomonas stutzeri…) ne poussant qu’en surface d’un tube de gélose profonde sans nitrate, est capable de respirer des nitrates en anaérobiose et par suite de croître sur toute la longueur du milieu en dégageant des bulles de gaz (azote). En effet, dans la dénitrification les ions nitrates jouent, en anaérobiose le même rôle que l’oxygène en aérobiose (respiration anaérobie des nitrates).

MILIEU HYPERTONIQUE à 6,5% DE NaCl

Ce milieu sert pour l’identification des Streptocoques fécaux D (“milieu hostile”).


FORMULE
.
Bouillon nutritif: 1000 ml
Tryptone: 15
Sodium chlorure: 65
Agar: 15


Stériliser à 120°C pendant 20 minutes.
Au sortir de l’autoclave, ajuster le pH à 7 +/- 0,2 .

Ajouter : lait écrémé 5 ml

Agiter et filtrer à chaud rapidement.
Répartir en tubes ou en fioles. Autoclaver pendant 20 minutes à 118°C.
Conserver au frais et à l’obscurité.

MILIEU D’ISOLEMENT SELECTIF de Legionella pneumophila

Ce milieu est recommandé pour l’isolement de Legionella pneumoniae dans le cadre de la norme AFNOR T0-431 relative à la recherche et au dénombrement de celle si dans les eaux.

L’extrait de levure et l’alpha-cétoglutarate favorise le développement de Legionella. Le chlorhydrate de cystéine et le pyrophosphate de fer sont des facteurs de croissance essentiel de ces bactéries. Le charbon actif agit comme détoxifiant. Le tampon maintient le pH à un optimum de croissance soit pH 6-8.

Les bacilles Gram négatifs sont inhibés par la polymixine à l’exception des bactéries appartenant au groupe des Proteus. La cycloheximide inhibe le développement des levures. La vancomycine est un antibiotique à large spectre.


FORMULE (en g/l d’eau distillée)

a) milieu de base[/u]
Extrait de levure: 10
Chlorhydrate de cystéine: 0.4
Pyrophosphate de fer: 0.25
Alpha-cétoglutarate: 1
Charbon actif: 2
Tampon ACES: 10
agar:15.00

La sélectivité de ce milieu est obtenue par adjonction de :

b) supplément de sélectivité
Polymyxine B: 100 000 UI
Vancomycine: 1 mg
Cycloheximide: 80 mg
Glycine: 3g

c) tampon acide
Acide chlorhydrique HCl 0.2 mol/l: 3.9 ml
Potassium chlorure KCl 0.2 mol/l: 25 ml



UTILISATION

Le principe consiste en un ensemencement direct de l’échantillon sur milieu sélectif, et en parallèle une filtration sur membrane avec remise en suspension. Le concentré est ensemencé sur milieu sélectif avant et après décontamination par traitement thermique et acide.

- L’eau à analyser est ensemencée sur milieu sélectif à raison de 0.2 ml par boîte.
- 0.5 ml d’eau à analyser sont ensuite ajoutés à 4.5 ml de tampon PBS et 0.2 ml du mélange est ensemencé sur milieu sélectif.
- 1 litre d’eau à analyser est filtré sur membrane 0.2µ. Cette dernière est : soit grattée stérilement et les cellules resuspendues sdans 5 ml d’eau à analyser, soit elle est mise dans une cuve à ultra-sons avec 5 ml d’eau à analyser pendant 2 à 10 minutes.
Le concentré obtenu est alors traité :
• 0.1 ml est ensemencé sur milieu sélectif,
• traitement thermique : 2 ml de concentré sont placés dans un bain-marie à 50°C pendant 30 minutes, 0.1 ml est ensemncé ensuite sur milieu sélectif.
• Traitement acide : à 2 ml de concentré sont ajoutés 2 ml de tampon acide, laisser en contact 5 minutes et ensemencer 0.2 ml sur milieu sélectif ( ou 2 ml de concentré + 2ml de tampon acide sont centrifuges à 60 000 m.s-2 pendant 10 minutes, oter 1 ml de surnageant, agiter vigoureusement, ajouter 1 ml de tampon acide, agiter doucement, laisser en contact 5 minutes et ensemencer 0.1 ml sur milieu sélectif.

Mettre toutes les boîtes à l’étuve à 37 °c pendant 10 jours.
La lecture s’effectue à 3,5 et 10 jours

Les colonies de Legionella apparaissent au bout de 3 à 4 jours. Elles sont muqueuses, de couleur blanc bleuâtre à bord net rosé, translucides, mesurant 2 à 3 mm. A la loupe binoculaire elles ont un aspect de verre frité.

Compter les boîtes contenant entre 1 et 50 colonies.
En présence de 1 à 5 colonies : repiquer toutes les colonies,
En présence de 6 à 50 colonies : repiquer 5 à 7 colonies

Ensemencer les colonies sur :
- milieu Légionella sans cystéine
- gélose au sang de mouton
- milieu Légionella non sélectif

Incuber à 37°C pendant 3 jours.
La présence de Légionella est confirmée si : le milieu Légionella sans cysteine est négatif,
la gélose au sang de mouton ne donne aucune pousse,
s’il existe une culture sur milieu Légionella non sélectif.

Compter alors les colonies d’aspect granuleux et présentant une coloration gris-bleu, pouvant devenir blanchâtre et qui se révèlent être des bactéries Gram-négatif

La confirmation des cultures et la recherche des sérogroupes doit être ultérieurement envisagée.

MOELLER, LDC, ODC, ADC, ADH
(Milieu liquide pour la recherche des décarboxylase et dihydrolase bactériennes

Les bactéries peuvent dégrader les acides aminés en empruntant des voies très diverses. Les décarboxylases scindent les acides aminés entraînant la formation de l’amine correspondante et la libération de CO2.

L’importance taxonomique des décarboxylases, hautement spécifiques, est considérable surtout en ce qui concerne :
L.D.C
*La lysine décarboxylase ou L.D.C. (lysine ----------> cadavérine)
O.D.C.
*L’ornithine décarboxylase ou O.D.C. (ornithine---------->putrescine)
A.D.C.
*L’arginine décarboxylase ou A.D.C. (arginine-----------> agmatine : difficile à différencier d’une autre enzyme interférant dans la dégradation de l’arginine)
A.D.H.
*L’arginine dihydrolase ou A.D.H. (arginine--------->ornithine)

Il s’agit d’enzymes induites dont la synthèse est favorisée par un pH acide (3,5-5,5) et des conditions d’anaérobiose.
Cette méthode repose sur le principe de la modification du pH du milieu: la production d’amine entraîne une alcalinisation facilement mise en évidence par le virage d’un indicateur de pH.

MOELLER détermina l’utilité de connaître ces propriétés enzymatiques dans l’identification des Enterobacteriaceae. CARLQUIST développa un milieu permettant la réaction de la lysine décarboxylase pour différencier Salmonella arizonae de Citrobacter. FALKOW obtint des résultats pour différencier Salmonella de Shigella avec un milieu lysine décarboxylase. Ultérieurement, EWING, DAVIS et EDWARDS étendirent le milieu aux réactions ornithine et arginine décarboxylase.
Ils conclurent que la méthode MOELLER pouvait être considérée comme méthode de référence, bien que la formule de FALKOW soit convenable pour déterminer les réactions carboxylase de la plupart des Enterobacyteriaceae, excepté pour Klebsiella et Enterobacter.

Le milieu de MOELLER est particulièrement utile dans l’identification d’Aeromonas, Plesiomonas, Vibrio spp, et les bacilles Gram-négatifs non fermentatifs.

La décarboxylation de la lysine est recherchée dans le projet final de norme internationale ISO/FDIS 6579 (2001) concernant la méthode horizontale pour la recherche des salmonella spp. La décarboxylation de l’ornithine est recherchée dans la norme AFNOR V08-027 (ISO 10273) concernant les directives générales pour la recherche des Yersinia enterolitica présumées pathogènes.


PRINCIPE

a) Chez les bactéries à métabolisme fermentatif:
La fermentation du glucose entraîne une baisse du pH suffisante (virage au jaune) pour favoriser l’expression de l’enzyme. L’alcalinité, due à l’amine produite, entraîne ensuite le virage de l’indicateur au violet (pH>7). Si la bactérie étudiée ne possède pas de décarboxylase, le milieu restera acide, donc jaune; ce sera également l’aspect du tube témoin sans amino acide.


b) Chez les bactéries à métabolisme oxydatif:
Pour pallier l’absence de fermentation du glucose, nous déterminons le volume de solution tamponnée de pH 4 qu’il faut ajouter au milieu témoin pour obtenir un virage au jaune (pH<5,4)
Après culture, l’addition de ce volume au milieu contenant les amino acides permet de conclure à l’absence ou à la présence des enzymes concernées, selon qu’elle entraîne ou non un virage à l’acidité. A appliquer par exemple, dans le cas de Pseudomonas.


FORMULE (en g/l d’eau distillée)

a) Milieu de base (selon FALKOW)

Peptone: 5
Extrait de levure: 3
Glucose: 1
Pourpre de bromocrésol: 0.02


* Du chlorure de sodium peut être ajouté à ce milieu pour permettre la croissance de bactéries halophiles telles que Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus, Listonella anguillarum....
Dans le cadre de la norme sur la recherche des salmonella , il n’est pas nécessaire de mettre de la peptone dans le milieu.

b) milieu à la lysine, à l’arginine et à l’ornithine

Ajouter au milieu de base séparément selon la recherche souhaitée, 0,5% de L-lysine (monohydrochlorure), 0,5% de L-ornithine (monohydrochlorure) ou 0,5% de L-arginine (monohydrochlorure) et un lot témoin sans amino acide.

Répartir en tubes étroits de 95 x 100 à raison de 4,5 ml par tube.
Stériliser 15 minutes à 120°C.


UTILISATION ET LECTURE

A partir d’une suspension épaisse de la souche à étudier, ensemencer chacun des tubes avec 2 à 3 gouttes de pipette Pasteur au dessous de la surface.
Recouvrir avec 1 ml d’huile de vaseline stérile, sauf dans le cas de bactéries à métabolisme oxydatif.

Incuber pendant 4 jours à température adéquate. Dans le cas de la recherche des Salmonella, incuber à 37°C +/-1°C durant 24 h +/- 3 h.

Si le témoin Falkow sans acide aminé présente un virage au jaune, les autres milieux doivent être examinés; jaune (négatif), violet (positif)

Si dans les tubes de milieu, y compris le milieu témoin sans amino acide, nous observons que la croissance bactérienne n’entraîne aucun virage acide (coloration des quatre tubes de milieu en violet) l’absence de fermentation du glucose doit orienter le diagnostic vers une bactérie aérobie stricte.

Dans ce cas, les tubes sont ensemencés avec 5 à 7 gouttes d’une suspension épaisse de bactéries. NE PAS RECOUVRIR D’HUILE DE VASELINE.
Incuber 48 heures à 30°C.

Verser goutte à goutte, une solution de tampon pH 4 dans chacun des tubes du milieu. Agiter quelques secondes après l’addition de chaque goutte. Chaque tube reçoit le même nombre de gouttes jusqu’à virage acide du tube témoin (virage au jaune).Ajouter alors dans les tubes de milieu restés alcalins (mauve) trois gouttes supplémentaires puis agiter.

Résultat négatif : virage au jaune
Résultat positif : virage au violet

- Dans le cadre de la norme ISO/FDIS 6579 les autres recherches biochimiques complémentaires sont : la décomposition de l’urée , la décarboxylation de la lysine, la réaction à la b-galactosidase, la réaction de Voges Proskauer et la recherche de l’indole. Les caractéristiques biochimiques des salmonella sont données dans le tableau ci-dessous.

Gélose MOSSEL

Le milieu de Mossel est utilisé pour dénombrer les formes végétatives et les spores de Bacillus cereus dans les denrées alimentaires. Il est recommandé par la Direction des Services Vétérinaires.

En 1967, MOSSEL et coll. ont préconisé l’utilisation d’un milieu mannitol-rouge de phénol-jaune d’œuf dont le principe de fonctionnement est fondé sur l’es éléments suivants :

- Bacillus cereus est mannitol-négatif. La teneur du milieu en mannitol permet donc de séparer la flore secondaire mannitol-positive qui est mise en évidence par un virage au jaune de l’indicateur de pH, le rouge de phénol.
- Bacillus cereus est assez résistant à certaines concentrations de polymyxine qui suffisent à inhiber la flore secondaire habituelle. L’addition de polymyxine n’est nécessaire qu’en cas de forte contamination par d’autres germes.
- Bacillus cereus synthétise et sécrète plus ou moins fortement de la lécithinase. Les produits insolubles de l’hydrolyse de la lécithine du jaune d’œuf s’accumulent en un précipité sur et autour des colonies de Bacillus cereus. Pour de nombreuse souches, l’action de la lécithinase se manifeste très vite, ce qui permet une identification rapide des colonies de B. cereus avant que des germes secondaires, résistant à la polymyxine, aient atteint leur plein développement.

[u]FORMULE (en g/l d’eau distillée) [/u]
.
Peptone: 10
Extrait de viande: 1
Sodium chlorure: 10
Mannitol: 10
Rouge de Phénol: 0.025
Sulfate de polymyxine B: 0.010
Agar: 14


Chauffer lentement en agitant fréquemment puis porter à ébullition jusqu’à complète dissolution
Répartir à raison de 90 ml par flacon de 150 ml.
Stériliser à l’autoclave à 120°C pendant 15 minutes.

UTILISATION ET LECTURE

Au moment de l’emploi, faire fondre au bain-marie bouillant puis refroidir vers 50°C. Ajouter alors, à 90 ml de base précédente, 10 ml d’une émulsion stérile de jaune d’œuf à 20%. Couler en boîte de Petri, laisser solidifier, puis sécher les boîtes à l’étuve.

Après broyage éventuel du produit à analyser, étaler 0,1 ml et 0,1 ml de différentes dilutions décimales de l’aliment à la surface d’une série de boîtes de Petri. Incuber à 30°C et examiner après 24 puis 48 heures de culture.

Les cultures de Bacillus cereus sont plates, irrégulières, rugueuses; elles ont une tendance envahissante.
Ces colonies sont rouges (mannitol -), entourées d’une zone d’opacification du milieu due à la lécithinase de ce micro-organisme.

Si l’on veut préciser l’identité du germe, une colonie est isolée sur gélose nutritive ordinaire : on confirme alors les principaux caractères de la souche, en particulier : morphologie, réduction des nitrates, gélatinase, amylase et production d’acéthyl-méthyl-carbinol.

MOX
(Oxford modifié au Moxalactam)

Ce milieu est recommandé dans la méthode de dénombrement de Listeria monocytogenes dans les produits végétaux ou d’origine végétale (BOCCRF du 30 mai 1992 rectifié le 5 septembre 1992). Il peut remplacer le milieu Oxford Curtis classique ou le Palcam ou bien encore utilisé en parallèle comme milieu sélectif.

Ce milieu contient un inhibiteur de la croissance des bactéries Gram – ( en particulier les entérobactéries) qui peuvent être nombreuses dans les produits considérés.


FORMULE (en g/l d’eau distillée)
.
A) Milieu de base

Gélose Columbia modifiée: 38.10
Esculine: 1
Fer (III) ammonium citrate : 0.50
Lithium chlorure: 15
colistine: 0.01
Agar: 13


Dissoudre la quantité nécessaire de produits pour 500 ml d’eau distillée et chauffer au bain-marie bouillant jusqu’à dissolution complète.
Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes.
Refroidir à 50°C.

B) Supplément sélectif

Moxalacta: 0.02
Eau : 2 ml

Dissoudre et filtrer stérilement sur membrane.
Ajouter au milieu refroidi

Couler aussitôt en boîtes de Petri. Les boîtes ainsi préparées peuvent se conserver quinze jours entre 0 et 5°C.


UTILISATION ET LECTURE

L’ensemencement s’effectue avec 0,1 ml d’échantillon si le produit est liquide ou 0,1 ml de la suspension mère si le produit est solide. Etaler à la surface d’une boîte bien sèche et/ou une boîte de milieu d’isolement dePalcam Curtis et/ou de Palcam. Répéter cette opération avec les dilutions suivantes.
Etaler le plus rapidement possibleet laisser sécher les boîtes environ 15 minutes à la température ambiante.
Examiner chacune des boîtes d’isolement après 18 à 24 heures et si nécessaire 48 h d’incubation.

Listeria monocytogenes pousse en colonies brun gris avec un halo noir (dégradation de l’esculine). Après 48 heures d’incubation, les colonies typiques ont un diamètre d’environ 2 mm, sont incrustées dans la gélose et présentent une dépression centrale.

Dans la méthode de dénombrement ne retenir que les boîtes contenant entre 15 et 150 colonies.
Sélectionner cinq colonies typiques sur chaque boîte. S’il y en a moins de cinq, les retenir toutes. Repiquer chaque colobie sur milieu T.S.A.Y.E.

Il est conseillé de procéder à des tests complémentaires morphologiques, physiologiques et biochimiques (galerie de tubes ou galeries miniaturisée, catalase, coloration de Gram, mobilité, test de CAMP, hémolyse, fermentation du xylose et du rhamnose) .

M.R.S.
(Bouillon de Man ; Rogosa et Sharpe)

Le bouillon M.R.S. est un milieu sélectif employé pour la culture des Lactobacillus. Il permet la réalisation des subcultures à partir des colonies isolées sur le milieu gélosé.

Pour la culture des Lactobacilles, de MAN, ROGOSA et SHARPE ont, en 1960, développé la formulation d’un milieu susceptible de convenir aux Lactobacilles des produits laitiers, et ceci sans jus de tomate à rajouter.

Les diverses peptones, le glucose et les sels de manganèse et de magnésium apportent des éléments nutritifs indispensables à la croissance des lactobacilles.
Le tween 80, mélange d’esters oléiques est une source d’acides gras nécessaires à la croissance de ces germes.
Le phosphate dipotassique contribue à stabiliser le pH au cours de la croissance bactérienne.
Le citrate d’ammonium et l’acétate de sodium constituent les substances inhibitrices du développement de la plupart des contaminants tels que les Streptocoques et les moisissures.
Le pouvoir inhibiteur du milieu est dû à son pH acide. Il est limité à certaines souches d’entérobactéries et à des cocci Gram + ( Staphylocoques, Microcoques).

Etant donné que la sélectivité du milieu MRS est faible, des espèces de Pediococcus et de Leuconostoc ainsi que d’autres germes (tels les Bacillus et les levures) peuvent s’y développer simultanément.


FORMULE (en g/l d’eau distillée)
.
Peptone: 10
Extrait de viande: 10
Extrait de levure: 5
Sodium acétate: 5
Di-potassium hydrogénophosphate: 2
Ammonium citrate: 2
Magnésium sulfate*: 0.10
Manganèse sulfate: 0.05
Glucose: 20
Tween 80: 1 ml


Mélanger soigneusement les ingrédients.
Répartir en tubes à raison de 10 ml par tube.
Stériliser à l’autoclave à 1231°C pendant 15 minutes.


UTILISATION ET LECTURE

En bouillon MRS, la culture de la majorité des espèces de Lactobacillus est très abondante après 24 à 36 heures à 37°C.

Le bouillon MRS peut être également utilisé pour différents tests d’identification de ces bactéries, tels que :


- la température optimale de croissance :
* Thermobacterium
culture à 45°C : positive
culture à 15°C : négative

*Streptobacterium
culture à 45°C : négative
culture à 15°C : positive

- la culture en présence de 0,4% de teepol, test très utile pour la caractérisation des Streptobacterium.

- l’étude des fermentations sucrées. L’addition d’une cloche de Durham permettra de caractériser le type fermentaire : homofermentaire ou hétérofermentaire

M.R.S. gélose
(Gélose de Man ; Rogosa et Sharpe)

Ce milieu gélosé est employé pour la culture et le dénombrement des Lactobacilles.

Pour la culture des Lactobacilles, de MAN, ROGOSA et SHARPE ont, en 1960, développé la formulation d’un milieu susceptible de convenir aux Lactobacilles des produits laitiers, et ceci sans jus de tomate à rajouter.

Les diverses peptones, le glucose et les sels de manganèse et de magnésium apportent des éléments nutritifs indispensables à la croissance des lactobacilles.
Le tween 80, mélange d ‘esters oléiques est une source d’acides gras nécessaires à la croissance de ces germes.
Le phosphate dipotassique contribue à stabiliser le pH au cours de la croissance bactérienne.
Le citrate d’ammonium et l’acétate de sodium constituent les substances inhibitrices du développemnt de la plupart des contaminants tels que les Streptocoques et les moisisssures.
Le pouvoir inhibiteur du milieu est dû à son pH acide. Il est limité à certaines souches d’entérobactéries et à des cocci Gram + ( Staphylocoques, Microcoques).

Etant donné que la sélectivité du milieu MRS est faible, des espèces de Pediococcus et de Leuconostoc ainsi que d’autres germes (tels les Bacillus et les levures) peuvent s’y développer simultanément.


FORMULE (en g/l d’eau distillée)
.
Peptone: 10
Extrait de viande: 10
Extrait de levure: 5
Sodium acétate: 5
Di-potassium hydrogénophosphate: 2
Ammonium citrate: 2
Magnésium sulfate: 0.10
Manganèse sulfate: 0.05
Glucose: 20
Tween 80: 1 ml
Agar.: 15

Répartir en flacons de capacité adéquate.
Stériliser à l’autoclave à 121°c pendant 15 minutes


UTILISATION

Lors de l’ensemencement et de l’incubation de la gélose MRS, plusieurs techniques peuvent être utilisées pour protéger certains Lactobacillus de leur relative sensibilité à l’oxygène de l’air :

1) Placer dans la boîte de Petri, 1 ml du produit homogénéisé ou 1 ml des différentes dilutions décimales effectuées dans une solution de pastone-sel (diluant).
Verser rapidement dans chaque boîte, environ 15 ml de gélose MRS, fondue au bain marie bouillant et maintenue en surfusion à 45-50°C environ.
Homogénéiser parfaitement. Laisser refroidir sur une surface fraîche et horizontale.

2) Couler 10 ml environ de gélose MRS, fondue au bain marie bouillant dans une boîte de Petri. Après solidification, ensemencer 0,1 ml du produit ou des dilutions décimales à la surface du milieu.
Recouvrir l’inoculum d’une seconde couche du même milieu fondu au bain marie bouillant et maintenu en surfusion à 45°C ( maximum).
Cette couche aura une épaisseur de 2 à 3 mm
Placer sur une surface fraîche et horizontale pour obtenir une gélification rapide. Cette technique dite de la « double couche », donne de bons résultats.

3) Les boîtes ensemencées comme en « 1 » et « 2 » (mais sans double couche) peuvent être incubées en atmosphère anaérobie, sous azote enrichie de 10% de CO2.

4) On peut également incuber les boîtes en anaérobiose en ayant recours aux méthodes habituellement utilisées pour les bactéries anaérobies.
Cependant il est à noter que certains Lactobacillus hétérofermentaires (Betabacterium) se développent mieux en aérobiose qu’à l’abri de l’air.


LECTURE

Les colonies de Lactobacillus apparaissent après 24 à 36 heures d’incubation à 30°C, ou à température supérieure pour les thermobacterium. D’un diamètre de 0,5 à 1 mm, elles ont des contours nets ou réguliers, leur forme est généralement circulaire, elles sont opaques, de consistance homogène ou discrètement granuleuse, incolores ou blanchâtres. Certaines espèces comme Lactobacillus bulgaricus se développent plus lentement. (36 à 48 heures).

Ne pas laisser la surface de la boîte se dessécher car cela occasionne une concentration en acétate qui inhibe la croissance.

Dénombre les colonies de Lactobacillus dans les boîtes contenant au moins 30 et, au plus 300 colonies.

Exprimer le résultat par 1 ml ou par 1 g d’échantillon analysé.

Remarques

1) Quand les Lactobacillus sont associés à d’autres micro-organismes acidophiles ou non, il est préférable d’employer un autre milieu sélectif pour leur isolement.
Le milieu de Rogosa, Mitchell et Wiseman est recommandé.
2) Il est parfois nécessaire de différencier les colonies de Lactobacillus de celles de Bacillus. Les caractères suivants peuvent être utilisés :

Bacillus

SPORULATION :+
CATALASE/ +
CYTOCHROME OXIDASE: +/-

Lactobacillus

SPORULATION: -
CATALASE: -
CYTOCHROME OXYDASE: -

MUELLER-HINTON Gélose

Le milieu de Mueller et Hinton est un milieu solide utilisé pour la recherche de la sensibilité des germes aux antibiotiques et aux sulfamides. Il constitue également un excellent milieu de base pour la préparation de la gélose au sang.

Dans leurs travaux de mise au point d’un milieu transparent capable de résister à l’autoclavage, MUELLER et HINTON ont sélectionné le milieu complexe de GORDON et HINE pour essayer d’en déterminer les composants essentiels. Les auteurs ont trouvé que l’amidon pouvait remplacer l’extrait de pois comme élément nutritif et aussi comme agent protecteur agissant contre les substances toxiques présentes dans le milieu. Par la suite, ils trouvèrent que la peptone pancréatique de viande pouvait être remplacée par de l’hydrolysat acide de caséine, favorisant ainsi la croissance des gonocoques et des méningocoques.

En 1966, BAUER, KIRBY , SHERVIS et TURCK recommandèrent le milieu de Muller Hinton pour l’étude de la sensibilité des germes aux antibiotiques par la méthode des disques. Enfin, une méthode standardisée de contrôle a été publiée par le « National Commitee for Clinical Laboratory Standards » pour la méthode de Kirby-Bauer.

Dans la norme NF ISO 10272 ( V 08-026) relative à la méthode horizontale pour la recherche des Campylobacter thermotolérants, le milieu Mueller et Hinton au sang est préconisé pour la recherche de la sensibilité à l’acide nalidixique et à la céphalotine.


FORMULE (en g/l d’eau distillée)

1) Milieu de base
Infusion de viande: 6
Hydrolysat de caséine: 17.5
Amidon: 1.5
Agar: 10


Porter à ébullition jusqu’à complète dissolution.
Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes.

2) Milieu au sang
Milieu de base: 950 ml
Sang de mouton stérile: 50 ml


Ajouter le sang stérilement au milieu de base préalablement fondu et refroidi à environ 47°C, et mélanger.
Verser environ 15 ml de milieu complet dans des boîtes de Petri stériles. Laisser se solidifier.

Juste avant emploi, sécher soigneusement les boîtes de milieu, de préférence après avoir retiré les couvercles et retourné les boîtes, dans une enceinte de séchage, pendant 30 minutes ou jusqu’à ce que la surface de la gélose soit exempte d’humidité.

Si elles ont été préparées à l’avance, les boîtes de milieu gélosé non séchées ne doivent pas être conservées plus de 4 heures à la température ambiante ou plus de 7 jours à +3°C ± 2°C.

UTILISATION ET LECTURE

- D’une manière générale le milieu Mueller et Hinton seul est employé dans la méthode de Kirby-Bauer. Cette dernière est basée sur la diffusion de substances antibiotiques imprégnées sur des disques en papier préalablement séchés qui doivent être déposés à la surface de la gélose. Les disques appliquées sur l’agar absorbent une quantité d’eau suffisante pour dissoudre l’antibiotique qui diffuse ainsi progressivement dans le milieu, suivant les lois physiques de diffusion de molécules à travers un gel.

Il se forme donc un gradient de concentration de l’antibiotique autour de chaque disque. Tandis que le mécanisme de diffusion se produit, la multiplication des germes ensemencés à la surface de l’agar intervient. Au moment où se manifeste la phase logarithmique de croissance, les bactéries se multiplient plus rapidement que la diffusion de l’antibiotique ne peut progresser et les cellules bactériennes non inhibées continuent à se multiplier jusqu’à ce que la culture puisse être visualisée. Aucune croissance n’apparaît lorsque l’antibiotique est présent aux concentrations inhibitrices. Il est alors possible de mesurer le diamètre de la zone d’inhibition qui est indirectement proportionnel aux concentrations minimales inhibitrices effectuées par la méthode en dilutions. Des tables permettent d’interpréter les résultats obtenus pour déterminer si les germes sont sensibles ou résistants à l’antibiotique mis en œuvre.

Au moment de l’emploi, faire fondre le milieu au bain-marie bouillant et le couler en boîte de Pétri. L’épaisseur de la couche de gélose doit être de 4 mm. Sécher les boîtes 30 minutes à 37°C. Diluer les cultures pures et ensemencer de façon à obtenir des colonies jointives mais non confluentes.

Poser les disques à 15 mm de la périphérie de la boîte et appuyer légèrement pour assurer le contact avec le milieu.

Incuber à 37°C pendant 18 heures.

Mesurer la zone d’inhibition avec un compas.

Se rapporter aux tableaux d’interprétation des zones d’inhibition fournis par les fabricants de disques d’antibiotiques pour établir les corrélations entre la zone d’inhibition et la concentration minimale inhibitrice (CMI)


-Dans le cadre de la méthode horizontale pour la recherche des Campylobacter5 thermotolérants, le milieu Mueller et Hinton au sang sert à la recherche de la sensibilité à l’acide nalidixique et à la céphalotine.

Dans ce cas, ensemencer à l’aide d’une anse bouclée, les colonies isolées sur Gélose Columbia et issues de la sélection au préalable des colonies pour confirmation, dans du bouillon Brucella afin de réaliser une suspension de turbidité 0,5 sur l’échelle de Mac Farland.

Diluer ensuite cette suspension au 1/10 dans le même bouillon.
Inonder la surface d’une boîte de gélose Mueller et Hinton à 5% de sang avec la suspension.
Sécher les boîtes à l’étuve à 37°C pendant 10 minutes.

Placer à la surface de la gélose un disque d’acide nalidixique ( 30µg) et un disque de céphalotine (30µg)
.
Incuber à 37°C en atmosphère microaérophile pendant 24 heures.

Interpréter la croissance bactérienne de la façon suivante :
- une croissance au contact du disque est classée comme résistante ;
- une présence d’une zone d’inhibition de la croissance (quelle que soit l’importance de la zone) est classée comme sensible.

Outre la recherche de la sensibilité à l’acide nalidixique et à la céphalotine, nous réliserons, pour confirmer la présence de Campylobacter thermotolérants, une coloration de Gram et on mettra en œuvre les études morphologiques (mobilité), physiologiques (croissance à 25°C) et biochimiques (fermentation du glucose, utilisation du lactose et/ou du saccharose ; production d’hydrogène sulfuré, recherche de la catalase,. de la de l’hydrolyse de l’hippurate)

Les Campylobacter thermotolérants sont de petits bacilles incurvés, à mobilité avec des déplacements en vrille caractéristiques, Gram -, oxydase +, glucose, lactose et saccharose négatifs.

Parmi les Campylobacter spp présentant une croissance à 42°C, certaines espèces constituent le groupe des thermotolérants dont les plus fréquemment rencontrés sont les Campylobacter jejuni et les Campylobacter coli. Cependant d’autres espèces ont été décrites ; les caractéristiques données dans le tableau ci-après permettent de les différencier.


Caractéristiques:

C. jejuni
Croissance à 25°C: -
H2S (TSI): -
Acide nalidixique: S
Hydrolyse de l’hippurate: +
Catalase: +
Céphalotine: R

C. coli
Croissance à 25°C: -
H2S (TSI): (+)
Acide nalidixique: S
Hydrolyse de l’hippurate: -
Catalase: +
Céphalotine: R

C. lari
Croissance à 25°C: -
H2S (TSI): -
Acide nalidixique: R
Hydrolyse de l’hippurate: -
Catalase: +
Céphalotine: R

C.upsaliensis
Croissance à 25°C: -
H2S (TSI): -
Acide nalidixique: S
Hydrolyse de l’hippurate: -
Catalase: - (ou faible)
Céphalotine: S

MULLER KAUFMANN au TETRATHIONATE et NOVOBIOCINE bouillon(MKTTn)

Le projet final de norme internationale ISO/FDIS 6579 :2001 spécifie une méthode horizontale de recherche des Salmonella, incluant la recherche de Salmonella typhi et Salmonella paratyphi.

Dans cette norme, le milieu d’enrichissement n’est plus le milieu au sélénite cystine mais le bouillon Mueller-Kaufmann au tétrathionate et à la novobiocine (MKTTn ) et le deuxième milieu d’enrichissement RVS remplace le milieu de Rappaport Vassiliadis classique.

FORMULE .

1) Milieu de base

Digestat enzymatique d’extrait de viande: 4,30 g
Digestat enzymatique de caséine: 8.60 g
Sodium chlorure: 2.60 g
Calcium carbonate: 38.70 g
Sodium thiosulfate anhydre: 47.80 g
Sels biliaires: 4,75 g
Vert brillant: 9,50 g
Eau distillée Q.S.P. 1000 ml


Dissoudre les composants dans l’eau et porter à ébullition pendant 5 minutes.
Répartir en tubes à raison de 10ml/tube dans des tubes stériles.
Le milieu peut se conserver au réfrigérateur pendant 4 semaines.

2) Solution iodo-iodurée

Iode: 20 g
Potassium iodure : 25 g
Eau distillée Q.S.P. 100 ml

Dissoudre complètement l’iodure de potassium dans 10 ml d’eau puis ajouter l’iode. Compléter à 100 ml avec de l’eau distillée.dans l’eau.
La solution peut être conservée dans un flacon en verre brun, à la température ambiante.

3) Solution de novobiocine

Sel monosodique de novobiocine: 0.04 g
Eau distillée: 5 ml

Dissoudre la novobiocine dans l’eau et stériliser par filtration sur membrane.
Conserver jusqu’à 4 semaines à 3°C2°C..

4) Milieu complet

Milieu de base: 1000 ml
Solution iodo iodurée: 20 ml
Solution de novobiocine: 5 ml

Ajouter aseptiquement la solution de novobiocine au milieu de base, mélanger puis ajouter la solution iodo-iodurée. Homogénéiser..
Le milieu complet doit être utilisé le jour de la préparation.


UTILISATION

Transférer 1 ml de la culture obtenue en milieu de pré-enrichissement non sélectif (eau peptonée tamponnée) dans un tube contenant 10 ml de bouillon Mueller-Kaufmann au tétrathionate et à la novobiocine et 0,1 mùl de cette même culture dans un tube contenant 10 ml de milieu Rappaport Vassiliadis au soja .

Incuber les deux milieux ensemencés. Le milieu MKTTn est placé à l’étuve à 37°C ±1°C pendant 24 h ± 3 heures.

A partir de la culture obtenue sur milieu MKTTn après 24 heures d’incubation, ensemencer avec une anse la surface d’une grande boîte de Petri (140mm) ou deux petites (90 à 100mm) du premier milieu d’isolement sélectif ( en gélose XLD ) de façon à permettre le développement de colonies bien isolées.

Opérer de la même façon avec le deuxième milieu sélectif en se servant d’une nouvelle anse.

Retourner les boîtes et les incuber dans l’étuve réglée 37°C ± 1°C.

Examiner les boîtes afin de rechercher la présence de colonies caractéristiques de Salmonella. Effectuer la confirmation en prélevant à partir de chaque boîte de milieu sélectif au moins une colonie considérée comme caractéristique ou suspecte puis quatre autres colonies si la première s’est révélée négative. S’il se trouve une boîte avec moins de cinq colonies caractéristiques ou suspectes, prendre toutes les colonies.

Ensemencer toutes les colonies en les isolant sur boîte de gélose nutritive afin de procéder aux tests complémentaires de confirmation.