K

KARMALI gélose

En général, la recherche des Campylobacter thermotolérants nécessite un enrichissement en milieu liquide (sur bouillon Preston ou bouillon de Park et Sanders) et une incubation en atmosphère micro-aérophile, suivi d’un isolement en gélose Karmali associé à un deuxième milieu au choix (Butzler, Skirrow, Preston, CCDA).

Ce milieu est préconisé dans la norme NF ISO 10272 (V 08-026) concernant la méthode horizontale pour la recherche des Campylobacter thermotolérants.

Le milieu a été décrit et utilisé avec succès par KARMALI en 1985 pour la numération de Campylobacter jejuni et de Campylobacter coli comparativement à des milieux nécessitant l’utilisation de sang de cheval. Karmali et coll. ont démontré que le milieu appelé C.S.M (Charcoal-based Selective Medium) inhibait plus efficacement les germes contaminants (Pseudomonas, microorganismes Gram-positifs, levures) que le milieu de Skirrow.
La formule de la gélose de Karmali est basée sur les deux observations fondamentales suivantes :
- la découverte par BOLTON et coll. que le charbon pouvait se substituer au sang dans les milieux pour Campylobacter.
- la démonstration par AHONKHAI et coll. de la résistance de Campylobacter jejuni à la céfopérazone.

La polypeptone favorise la croissance des colonies de Campylobacter.
L’extrait de levure est une source de complexe vitaminique B.
L’amidon représente la source énergétique du développement.
Le chlorure de sodium maintient l’équilibre osmotique.
Le charbon actif, le pyruvate et l’hématine sont des composés qui remplacent le sang des milieux antérieurement utilisés et favorisent la croissance et l’aérotolérance des Campylobacter.
La cycloheximide inactive le développement des levures.
La céfopérazone complète le spectre d’action de la vancomycine en provoquant une inhibition plus complète des bactéries contaminantes que celle réalisée par la céfazoline originellement incluse dans les milieux sélectifs au charbon.

Le milieu, à base de gélose Columbia est additionné de charbon actif.

Campylobacter est un bacille vibrionnaire de 0,2 à 0,5µm de large et de 0,5µ à 8µm de long possédant une ou plusieurs ondulations. Il est mobile par l’intermédiaire d’un flagelle présent à un ou deux pôles.
Son métabolisme respiratoire nécessite une teneur en oxygène allant de 1 à 15 % (optimum 5%) et une concentration en gaz carbonique de 3 à 5% ( quelques souches peuvent cultiver en aérobiose). Il ne fermente ni n’acidifie les glucides, possède une oxydase, n’hydrolysent pas la gélatine ni l’urée et ne produisent pas de pigments.

Les Campylobacter les plus importants se cultivent aussi à 42°C, nous les dénommons pour cela des Campylobacter thermotolérants par opposition avec Campylobacter fetus qui ne cultive pas à 42°C mais à 25°C.


FORMULE (en g/l d’eau distillée)

Substrat nutritif spécial: 23.0
Amidon: 1.0
Sodium chlorure: 5.0
Charbon actif: 4.0
Agar 13,0


Répartir le milieu dans des flacons appropriés.
Stériliser à l’autoclave 15 minutes à 121°C.


UTILISATION ET LECTURE

a) Isolement direct

Pour les produits suspectés contenir une quantité importante de Campylobacter thermotolérants, procéder à un isolement en ensemençant à l’aide d’une anse bouclée, la suspension mère non incubée sur la surface de la gélose KARMALI (milieu sélectif obligatoire préconisé par la norme) et éventuellement sur un autre milieu sélectif.

Incuber à 42°C en atmosphère micro-aérophile (oxygène 5%, dioxyde de carbone 10%, azote 85%).
Examiner après 48 h, 72 h et, éventuellement 5 jours, pour contrôler s’il y a présence de colonies présumées être des Campylobacter thermotolérants.
Procéder alors à la confirmation.


b) Après enrichissement

Ensemencer, à l’aide d’une anse bouclée, la surface d’une gélose KARMALI ainsi que la surface d’une gélose BUTZLER avec la culture obtenue dans le milieu d’enrichissement (Bouillon de PRESTON ou bouillon de PARK et SANDERS).
Incuber les boîtes à 42°C en atmosphère micro-aérophile.

Après 24 h, ou plus généralement, 48 h et même 3 jours à 5 jours d’incubation, examiner les boîtes afin de rechercher la présence de colonies caractéristiques de Campylobacter thermotolérants.

Les colonies caractéristiques sont grises, humides et plates, avec une tendance à l’étalement

Procéder ensuite à la confirmation en sélectionnant cinq colonies typiques et /ou suspectes sur l’ensemble des boîtes ensemencées ; s’il y en a moins de cinq, retenir toutes les colonies.

Comme les germes ne survivent qu’en atmosphère micro-aérophile, appliquer les tests ultérieurs sans délai.

A partir des colonies isolées, réaliser une coloration de Gram et mettre en œuvre les études morphologiques (mobilité), physiologiques (croissance à 25°C) et biochimiques (fermentation du glucose, utilisation du lactose et/ou du saccharose ; production d’hydrogène sulfuré, recherche de la catalase,. de la sensibilité à l’acide nalidixique et à la céphalotine, de l’hydrolyse de l’hippurate)

Les Campylobacter thermotolérants sont de petits bacilles incurvés, à mobilité avec des déplacements en vrille caractéristiques ( vol de moucherons), Gram -, oxydase +, glucose, lactose et saccharose négatifs.

Il est possible d’effectuer une coloration des flagelles par la méthode de Ribadeau et Dumas.

Ils se présentent aussi souvent sous forme coccoïde et notamment après 24 h de croissance. C’est une forme de dégénérescence qui s’avère très difficile à cultiver mais qui semble conserver son pouvoir pathogène, au moins au début. C’est une forme qui apparaît plus vite à 42°C.

Parmi les Campylobacter spp présentant une croissance à 42°C, certaines espèces constituent le groupe des thermotolérants dont les plus fréquemment rencontrés sont les Campylobacter jejuni et les Campylobacter coli. Cependant d’autres espèces ont été décrites ; les caractéristiques données dans le tableau ci-après permettent de les différencier.

C. jejuni :
croissance à 25°C: -
H2S (sur TSI): -
Acide nalidixique: S
Hydrolyse de l'hippurate:+
Catalase: +
Cephalotine: R

C. coli
croissance à 25°: -
H2S (sur TSI): (+)
Acide nalidixique: S
Hydrolyse de l'hippurate:-
Catalase: +
Cephalotine: R

C. lari
croissance à 25°: -
H2S (sur TSI): -
Acide nalidixique: R
Hydrolyse de l'hippurate:-
Catalase: +
Cephalotine: R

C. upsaliensis
croissance à 25°:-
H2S (sur TSI): -
Acide nalidixique: S
Hydrolyse de l'hippurate:-
Catalase: - (ou faible
Cephalotine: S

Selon l’interprétation des résultats, indiquer la présence ou l’absence de Campylobacter thermotolérants dans une prise d’essai de x g ou x ml de produit.

K. F. Gélose

Le milieu K.F (Kenner Fecal) mis au point par KENNER, CLARK et KABLER en 1960 est prévu pour la recherche et la numération des entérocoques dans l’eau, les denrées alimentaires et d’autres produits.

Ce milieu correspond aux recommandations de l’APHA pour l’analyse de l’eau et des aliments.

La forte nutrivité du milieu est due à une forte proportion de polypeptone, d’extrait de levures et de glucides.
Le chlorure de sodium maintient l’équilibre osmotique.
Le lactose et le maltose sont des sources d’énergie pour les microorganismes susceptibles de les utiliser.
L’acidification du milieu est révélée par le virage au jaune du pourpre de bromocrésol.
L’azide de sodium permet d’inhiber la croissance des microorganismes contaminants Gram-négatifs.
Le T.T.C rajouté extemporanément est un indicateur de croissance bactérienne. Il est réduit en formazan insoluble à l’intérieur de la cellule. Cette réaction se manifeste par l’apparition de colonies de couleur rouge à marron.

FORMULE (en g/l d’eau distillée)

Protéose peptone: 10.000
Extrait de levure: 10.000
Sodium chlorure: 5.000
Sodium glycérophosphate: 10.000
Maltose: 20.000
Lactose: 1.000
Sodium azide: 0.400
Pourpre de bromocrésol: 0.015
Agar 13.000


Autoclaver légèrement : 10 minutes à 121°C.
NE PAS SURCHAUFFER !
Après refroidissement à 50-60°C, introduire en mélangeant 10 ml d’une solution aqueuse à 1% de TTC (triphényl-2,3,5-tétrazolium chlorure) stérilisée par filtration sur membrane puis couler en boîtes de Petri.

UTILISATION ET LECTURE

Pour la recherche et la numération des entérocoques, il convient d’appliquer la méthode sur membranes filtrantes en présence d’un nombre probablement faible de germes et la méthode des boîtes coulées en présence d’un nombre probablement plus élevé.

Placer les membranes à la surface du milieu
Incuber enduite pendant 48 heures à 37°C.

Décompter les colonies rouges ou rouge rosé poussées à la surface de la gélose ou des membranes filtrantes et multiplier par le facteur de dilution correspondant.

KING A et B

Les milieux de King A et B sont destinés à la différenciation des espèces de Pseudomonas par la mise en évidence de leurs pigments spécifiques.
L’élaboration des pigments est influencée par la composition du milieu :

- la production de pyocyanine, due spécifiquement à Pseudomonas aeruginosa (bacille pyocyanique) est favorisée par la présence de certains acides aminés et d’ions inorganiques;

- la production de pyoverdine, caractéristique du groupe fluorescent, dépend de la nature des peptones et en particulier de la teneur en phosphate.
Joue également un rôle important, la présence de certains oligo-éléments.

Sur ces données ont été mis au point deux milieux électifs : l’un, le milieu A favorisant la production de pyocyanine et limitant celle de la pyoverdine, l’autre, le milieu B favorisant la formation de fluorescéine (pyoverdine) et inhibant celle de pyocyanine.

L’emploi simultané des deux milieux nutritifs permet une identification simple et rapide de la plupart des Pseudomonas, étant donné qu’il y a certaines souches qui forment exclusivement la pyocyanine ou la fluorescéine ou les deux colorants.

Il existe un milieu King B qui correspond au Dansk Standard qui utilise du tri-potassium phosphate-3-hydraté (1,8 g/l) au lieu du di-potassium hydrogénophosphate et évite une diminution du pH après l’autoclavage et donc une formation plus faible de fluorescéine.

FORMULE (en g/l d’eau distillée)

a. MILIEU A

Peptone: 20.0
Glycérol: 10.0
Di potassium sulfate (anhydre): 10.0
Magnésium chlorure (anhydre): 1.4
Agar: 15.0


b. MILIEU B

Protéose peptone n°3: 20.0
Glycérol: 10.0
Di potassium phosphate (anhydre): 1.5
Magnésium sulfate, 7 H2O: 1.5
Agar 15,0


Stériliser à 120°C pendant 15 minutes.

UTILISATION

Faire fondre la gélose dans un bain-marie d’eau bouillante. Refroidir vers 50°C.

Laisser les tubes en position inclinée (grande pente) jusqu’à ce que le milieu soit suffisamment solidifié.

Inoculer en stries un tube de milieu A et un tube de milieu B en faisant une strie médiane à la surface de la gélose avec une anse de culture prise dans un bouillon ou sur une gélose.

Replacer le bouchon sur chaque tube, sans le revisser. Incuber à 30°C pendant 1 à 4 jours (au-delà, l’incubation à l’étuve est inutile, mais on peut conserver les cultures à la température du laboratoire).


LECTURE

1) MILIEU A
Ce milieu est destiné à favoriser électivement la synthèse de la pyocyanine par Pseudomonas aeruginosa (bacille pyocyanique). La pyocyanine se manifeste en colorant le milieu de culture en bleu (ou en vert si Ps. aeruginosa synthétise également la pyoverdine ). En cas de doute, il suffit de verser 0,5 ml de chloroforme dans le tube et de laisser pendant quelques minutes le chloroforme au contact de la gélose, en position inclinée; la pyocyanine, très soluble dans le chloroforme, colore celui-ci en bleu (virage au rouge en ajoutant quelques gouttes d’un acide fort).

Les cultures peuvent être colorées en brun-rose (pyorubrine)

Le milieu n’a pas besoin d’être examiné au-delà du quatrième jour de culture.

2) MILIEU B
Ce milieu est destiné à favoriser la synthèse du pigment vert fluorescent (pyoverdine) par le bacille pyocyanique et divers autres Pseudomonas. La pyoverdine se manifeste en colorant le milieu de culture en vert fluorescent.
Le pigment n’est pas soluble dans le chloroforme. Certaines souches de Ps. fluorescens ou Ps. putida (provenant en général de l’eau et du sol) n’élabore que lentement la pyoverdine (incuber à 20°C pendant deux à trois semaines).

KLIGLER HAJNA gélose

Le milieu de Kligler est un milieu d’identification rapide pour les Entérobactéries. Il permet de mettre en évidence la fermentation du lactose et du glucose (avec ou sans dégagement gazeux) la production d’hydrogène sulfuré, la recherche du test O.N.P.G. et de la lysine décarboxylase (L.D.C.).

En 1911, RUSSEL décrivit un milieu à deux sucres pour l’isolement des bacilles typhiques dans les urines. Six ans plus tard, KLIGLER développa un milieu nutritif avec glucose, indicateur d’Andrade et acétate de plomb pour la différenciation des bactéries du groupe typhi et paratyphi. Alors qu’il expérimentait ce milieu avec d’autres combinaisons d’ingrédients, KLIGLER se rendit compte que le milieu de Russel avec indicateur d’Andrade et acétate de plomb permettait une excellente différenciation des salmonelles. Par la suite, BAILEY et LACEY préconisèrent l’utilisation de rouge de phénol comme indicateur de pH, qui se substituait à l’indicateur d’Andrade moins adapté à ce type de réaction. SULKIN et WILLETT utilisèrent le thiosulfate de sodium et le sulfate ferreux pour mettre en évidence la production de sulfure d’hydrogène.
La lecture du milieu peut révéler :
- Dans le culot (en anaérobiose relative), le glucose est toujours attaqué par voie fermentative et, bien qu’il soit en proportion faible, son attaque entraîne une acidification importante. Selon la voie de fermentation empruntée il y a ou non production de gaz (H2 ou CO2). Plus ou moins abondants, ces derniers peuvent entraîner seulement la formation de quelques bulles ou, au contraire, créer une poche qui décolle complètement le milieu du fond du tube. Que le lactose soit ou non attaqué, l’acidification produite suffit toujours à faire virer au jaune l’indicateur de pH.

- Sur la pente (en aérobiose), le glucose est attaqué surtout par voie oxydative. L’acidification produite sera donc faible, d’autant, rappelons-le que la quantité de glucose présente dans le milieu est faible. Si la bactérie ne peut que métaboliser le glucose (cas des bactéries lactose-négatives), la dégradation des acides aminés, très active en aérobiose et entraînant la formation de produits alcalins, va neutraliser la pente qui, après 24 heures d’incubation, apparaîtra rouge. Au contraire, les bactéries lactose-positives, oxydant et fermentant les quantités importantes de lactose présentes dans le milieu, acidifieront suffisamment pour que l’alcalinité due au métabolisme protéique n’interfère pas; en 24 heures, la pente apparaîtra donc jaune (teinte du rouge de phénol à pH acide).

Par ailleurs, la réduction du thiosulfate en anaérobiose par certaines entérobactéries se traduira par la formation de sulfure de fer noir en présence de citrate ferrique.

Les peptones très dégradées entrant dans la composition de ce milieu sont riches en acides aminés donc en lysine, d’où la possibilité de recherche de la lysine-décarboxylase.
Le milieu Kligler Hajna est préconisé comme milieu de confirmation dans les normes AFNOR NF V 08-027 (ISO 10273) relative aux directives générales pour la recherche des Yersinia enterolitica présumées pathogènes, NF V08-052 portant sur la méthode de routine pour la recherche des Salmonella, NF V 08-301 concernant l’examen microbiologique des produits déshydratés, NF V 04-504 relative au dénombrement des Pseudomonas dans les viandes et produits à base de viande, NF V 04-015 sur la microbiologie des laits de conserve.

FORMULE (en g/l d’eau distillée)
.
Extrait de viande de bœuf: 3.00
Extrait de levure: 3.00
Peptone: 20.00
Sodium chlorure: 5.00
Fer (III) citrate: 0.30
Sodium thiosulfate: 0.30
Lactose: 10.00
Glucose: 1.00
Rouge de phénol: 0.05
Agar: 12.00


Porter à ébullition jusqu’à dissolution complète. Bien mélanger et répartir. Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes. Refroidir en position inclinée de façon à former un culot de 3 cm de haut environ. Dès que la surface de la pente est sèche, le milieu est prêt à l’emploi.

Quand il a été préparé plus de 8 à 10 jours avant l’emploi, ce milieu doit , de préférence, être fondu au bain-marie bouillant puis solidifié à nouveau, en bonne position.

UTILISATION ET LECTURE

Ce milieu est ensemencé d’abord sur la pente, soit en strie centrale, soit en stries serrées et parallèles, puis en piqûre profonde dans le culot. Ne pas visser le bouchon à fond pour permettre l’aération du milieu.
Les tubes sont portés à l’étuve à 37°C pendant 24 heures.

Ce milieu fournit plusieurs indications :
Culture glucose-positive : culot jaune
Culture glucose-négative : culot inchangé
Culture lactose-positive : pente virant au jaune
Culture lactose-négative : pente alcalinisée (rouge groseille)
Culture H2S-positive : noircissement du milieu dans la zone joignant la pente et le culot. Dans le cas de dégagement très abondant, toute la partie inférieure du tube peut être noircie.
Production de gaz : bulles dans la masse du milieu ou contre les parois ou poche gazeuse décollant le culot, repoussant même parfois la totalité du milieu vers le haut du tube.

REACTIONS COMPLEMENTAIRES

a) Recherche de la lysine décarboxylase: METHODE A LA NINHYDRINE

Il est possible sur ce milieu de mettre en évidence la transformation, par certaines espèces qui possèdent une lysine décarboxylase (L.D.C.), de cet acide aminé en cadavérine.

-Technique et lecture
Après incubation de 18-24 heures, ajouter sur le milieu 1 ml de lessive de soude diluée de moitié, de façon à baigner la surface. Agiter légèrement.
Rajouter 2 ml de chloroforme. Agiter pendant quelques secondes sans violence. Laisser décanter.
Prélever au moyen d’une pipette Pasteur dont l’extrémité est réeffilée, environ 0,5 ml de chloroforme limpide dans le fond du tube et le transvaser dans un petit tube (il est important de ne pas emmener de phase aqueuse.)
Ajouter un volume approximativement égal d’une solution de ninhydrine à 0,1% dans le chloroforme. Cette solution doit être conservée à +4°C dans un flacon de verre teinté, bouché à l’émeri et non en caoutchouc.

Une réaction positive se traduit par une coloration violette apparaissant au bout de 5 à 10 minutes.
Cette réaction est positive avec les Salmonella, la majorité des E. coli et Alkalescens dispar, les Klebsiella (sauf Klebsiella ozonae et rhinoscleromatis ).
Elle est toujours négative avec les Proteus, Citrobacter et Shigella.
Elle permet donc de séparer rapidement les Salmonella (L.D.C.+) des Citrobacter (L.D.C.-).
Cette méthode à la ninhydrine a l’avantage de ne pas nécessiter de milieu supplémentaire. Elle a l’inconvénient de nécessiter une extraction par le chloroforme en milieu alcalin et l’addition d’une solution de ninhydrine. Elle est cependant d’utilisation aisée par ceux qui y sont habitués.

b) Test à l’O.N.P.G.

Ce test peut être également effectué à partir de nombreuses cultures sur milieux glucosés-lactosés

Technique et lecture
Faire une suspension dense de la culture dans 0,25 ml d’eau physiologique contenue dans un tube à hémolyse, y ajouter 0,25 ml de solution tamponnée d’O.N.P.G.
Plus simplement, ajouter à une suspension dense dans 0,5 ml d’eau physiologique un disque d’O.N.P.G.
Chez les espèces pigmentées en jaune (Enterobacter agglomerans , Flavobacterium, Xanthomonas...) ou en rouge (Serratia...), doubler le volume de la suspension, utiliser 0,5 ml de cette suspension sans disque O.N.P.G. comme témoin de couleur pour faciliter les lectures.

Réaction O.N.P.G.+ : coloration jaune
Réaction O.N.P.G. - : pas de coloration
Examiner les tubes après 15 min, 30 min, 1 h, 6 h et 24 h. La majorité des réactions positives sont observées entre 15 et 30 minutes. La réaction est d’autant plus rapide qu’il y a plus de bactéries en suspension, donc plus d’enzyme.
Ne pas prolonger les lectures au-delà de 24 heures.